鐵負(fù)荷狀態(tài)對(duì)骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細(xì)胞株SKM-1甲基化狀態(tài)的影響.pdf

1、第一部分 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱對(duì)SKM-1細(xì)胞P15INK4B基因甲基化狀態(tài)的影響
　　目的:研究DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱(DAC)對(duì)骨髓增生異常綜合征(MDS)轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞株SKM-1 P15INK4B基因甲基化狀態(tài)的影響。
　　方法:DAC處理組分為3組，分別以1.5μ mol/L、3.0μmol/L和6.0μmol/L DAC處理SKM-1細(xì)胞48h，以未加DAC的SKM-1細(xì)胞培養(yǎng)48h作為對(duì)照組。甲

2、基化特異性PCR(MSP)檢測各組細(xì)胞P15INK4B基因甲基化情況，Real time RT-PCR相對(duì)定量法檢測P15INK4B基因mRNA表達(dá)情況，羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)法檢測細(xì)胞增殖抑制情況，碘化丙啶(PI)單染法檢測細(xì)胞周期，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞早期凋亡情況。
　　結(jié)果:(1)對(duì)照組SKM-1細(xì)胞的P15INK4B基因完全甲基化，未出現(xiàn)非甲基化條帶，在1.5μ mol/L、3

3、.0μ mol/L和6.0μ mol/L DAC處理組，P15INK4B基因甲基化條帶逐漸變淺，非甲基化條帶出現(xiàn)并逐步加深;(2)對(duì)照組、1.5μ mol/L、3.0μ mol/L和6.0μ mol/L組的P15INK4B基因mRNA表達(dá)水平分別為1.00±0.12、0.91±0.13、0.51±0.06和0.43±0.04，與對(duì)照組相比，3.0μ mol/L組和6.0μ mol/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DAC處理組兩兩比

4、較，3.0μ mol/L組和6.0μ mol/L組與1.5μ mol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);6.0μmol/L組與3.0μ mol/L組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(3)對(duì)照組、1.5μ mol/L、3.0μ mol/L和6.0μ mol/L組的CFSE平均熒光強(qiáng)度(MFI)分別為51.67±1.61、55.33±2.28、56.33±2.50和55.71±2.87，與對(duì)照組相比，3.0μ mol/L組

5、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，1.5μ mol/L組和6.0μ mol/L組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;DAC處理組兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);(4)對(duì)照組、1.5μ mol/L、3.0μmol/L和6.0μ mol/L組的G1期細(xì)胞比例分別為55.78±3.61％、48.12±2.93％、51.69±1.60％和46.71±1.54％，S期細(xì)胞比例分別為44.22±3.61％、51.88±2.93％、48.31

6、±1.60％和53.29±1.54％，與對(duì)照組相比，1.5μ mol/L組和6.0μmol/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，3.0μ mol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);DAC處理組兩兩比較，6.0μ mol/L組與3.0μ mol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;(5)對(duì)照組、1.5μ mol/L、3.0μ mol/L和6.0μ mol/L組的早期凋亡率分別為2.91±

7、0.26％、7.77±0.22％、12.45±0.28％和13.86±0.27％，與對(duì)照組相比，DAC處理組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;DAC處理組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:DAC能逆轉(zhuǎn)SKM-1細(xì)胞的P15INK4B基因完全甲基化狀態(tài)，在一定程度上抑制SKM-1細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞分化阻滯在S期，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡;尚未發(fā)現(xiàn)DAC逆轉(zhuǎn)P15INK4B基因甲基化狀態(tài)的同時(shí)使沉默的P15INK4B基

8、因mRNA重新表達(dá)。
　　第二部分鐵螯合劑去鐵胺對(duì)SKM-1細(xì)胞P15INK4B基因甲基化狀態(tài)的影響
　　目的:研究鐵螯合劑去鐵胺(DFO)對(duì)SKM-1細(xì)胞P15INK4B基因甲基化狀態(tài)的影響。
　　方法;以枸櫞酸鐵銨(FAC)和DFO處理SKM-1細(xì)胞，按不同鐵負(fù)荷分成3組:對(duì)照組、FAC組和FAC+DFO組，分別檢測不同鐵負(fù)荷組SKM-1細(xì)胞內(nèi)可變鐵池(LIP)、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)、P15INK4B基因甲基化狀

9、態(tài)、P15INK4B基因mRNA表達(dá)情況、細(xì)胞增殖抑制情況、細(xì)胞周期以及細(xì)胞早期凋亡情況。
　　結(jié)果:對(duì)照組SKM-1細(xì)胞的P15INK4B基因完全甲基化，未出現(xiàn)非甲基化條帶;FAC組SKM-1細(xì)胞的P15INK4B基因完全甲基化，也未出現(xiàn)非甲基化條帶;FAC+DFO組SKM-1細(xì)胞的P15INK4B基因甲基化條帶變淺，并出現(xiàn)非甲基化條帶;與對(duì)照組相比，F(xiàn)AC組的LIP(64.04±2.12 vs1.45±0.65)％、ROS(4

10、5.57±1.18 vs33.38±12.96)％明顯升高，CFSE的MFI(23.01±5.20 vs51.67±1.61)％、P15INK4B基因mRNA表達(dá)(0.72±0.08 vs1)和細(xì)胞早期凋亡率(1.76±0.11 vs2.91±0.25)％明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;與FAC組相比，F(xiàn)AC+DFO組的LIP(8.34±4.21 vs64.04±2.12)％、ROS(34.39±2.12 vs45.57±

11、1.18)％明顯減少，CFSE的MFI(37.34±6.61 vs23.01±5.20)％、P15INK4B基因mRNA表達(dá)(1.50±0.15 vs0.72±0.08)和細(xì)胞早期凋亡率(4.77±0.88 vs1.76±0.11)％明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;3組細(xì)胞的細(xì)胞周期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:鐵螯合劑DFO可使鐵過載的SKM-1細(xì)胞LIP和ROS降低，誘導(dǎo)鐵過載的SKM-1細(xì)胞P15INK4B基因

12、去甲基化，使其mRNA重新表達(dá)，并可抑制鐵過載的SKM-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)其早期凋亡。
　　第三部分地西他濱聯(lián)合去鐵胺對(duì)SKM-1細(xì)胞P15INK4B基因甲基化狀態(tài)的影響
　　目的:研究DAC聯(lián)合DFO對(duì)SKM-1細(xì)胞P15INK4B基因甲基化狀態(tài)的影響。
　　方法:以FAC、DFO和DAC處理SKM-1細(xì)胞，分成4組:對(duì)照組、FAC組、FAC+DFO組和FAC+DFO+DAC組，分別檢測不同處理組SKM-1細(xì)胞內(nèi)ROS

13、、P15INK4B基因甲基化狀態(tài)、P15INK4B基因mRNA表達(dá)情況、細(xì)胞增殖抑制情況、細(xì)胞周期以及細(xì)胞早期凋亡情況。
　　結(jié)果:(1)對(duì)照組、FAC組、FAC+DFO組和FAC+DFO+DAC組ROS的MFI分別為33.38±12.96、45.57±1.18、34.39±2.12和36.64±1.96，與FAC組相比，F(xiàn)AC+DFO組和FAC+DFO+DAC組的ROS明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);(2) MSP檢

14、測，對(duì)照組和FAC組僅出現(xiàn)M條帶，F(xiàn)AC+DFO組和FAC+DFO+DAC組M條帶變淺，并出現(xiàn)U條帶，P15INK4B基因呈完全甲基化狀態(tài)得到一定程度逆轉(zhuǎn)。(3)對(duì)照組、FAC組、FAC+DFO組和FAC+DFO+DAC組SKM-1細(xì)胞的P15INK4B基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.12、0.71±0.08、1.49±0.15和1.31±0.13，與FAC組相比，F(xiàn)AC+DFO組和FAC+DFO+DAC組的P15INK4B

15、基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);(4)對(duì)照組、FAC組、FAC+DFO組和FAC+DFO+DAC組SKM-1細(xì)胞CFSE的MFI分別為51.67±1.61、23.01±5.20、37.34±6.61和39.61±6.92，與FAC組相比，F(xiàn)AC+DFO組和FAC+DFO+DAC組CFSE的MFI增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);(5)對(duì)照組、FAC組、FAC+DFO組和FAC+DFO+DAC組S

16、KM-1細(xì)胞G1期比例分別為55.78±3.61％、50.2±9.20％、51.10±6.30％和49.58±3.38％，S期比例分別為44.22±3.61％、49.77±9.20％、48.90±6.30％和50.42±3.38％，與FAC組相比，F(xiàn)AC+DFO組和FAC+DFO+DAC組G1期細(xì)胞比例有下降，S期細(xì)胞比例有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(6)對(duì)照組、FAC組、FAC+DFO組和FAC+DFO+DAC組SKM

17、-1細(xì)胞的早期凋亡率分別為2.91±0.25％、1.76±0.11％、4.77±0.88％和8.94±0.87％，與FAC組和FAC+DFO組相比，F(xiàn)AC+DFO+DAC組SKM-1細(xì)胞的早期凋亡率均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TUNEL染色熒光顯微鏡觀察顯示FAC+DFO+DAC組早期凋亡細(xì)胞增加。結(jié)論:與單用DFO干預(yù)鐵過載的SKM-1細(xì)胞相比，聯(lián)用DFO和DAC雙重干預(yù)，P15INK4B基因甲基化狀態(tài)和mRNA表