硼替佐米對人骨髓增生異常綜合征細胞株MUTZ-1作用的實驗研究.pdf

1、目的： 骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一組異質(zhì)性造血干細胞克隆性疾病。以骨髓病態(tài)造血為特征，進行性、難治性外周血紅細胞、粒細胞及血小板減少為主要臨床表現(xiàn)。盡管傳統(tǒng)的對癥支持、化學療法、激素和細胞因子治療，近年來出現(xiàn)的多種新型藥物，如免疫調(diào)節(jié)劑和誘導分化劑等，能夠緩解疾病，延長患者的生存期，但目前本病仍缺乏有效的根治方法，又具有向白血病轉(zhuǎn)化的高風險，故近年WHO分型已將MDS歸類為

2、髓系造血系統(tǒng)惡性疾病。硼替佐米(Bortezomib，PS-341)是丙氨基酸硼酸衍生物的一種，為新型蛋白酶體抑制劑，因其獨特的抗腫瘤機制，臨床已經(jīng)廣泛用于多發(fā)性骨髓瘤和其他系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。但是目前國內(nèi)外有關(guān)PS-341對MDS細胞的作用罕見報道。本實驗旨在研究PS-341對人MDS細胞株MUTZ-1的作用并初步探討可能的作用機制，為臨床治療提供實驗依據(jù)。 方法： 1.采用MTT比色法檢測PS-341對人MDS細胞株

3、MUTZ-1體外生長的抑制作用。 2.瑞氏-姬姆薩(Wright-Giemsa)染色，油鏡下觀察細胞形態(tài)。 3.應(yīng)用流式細胞儀，AnnexinⅤ和PI雙染色，分析檢測細胞凋亡。 4.Western-blot方法檢測PS-341對MUTZ-1細胞凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase-3蛋白表達的影響。 5.Western-blot方法檢測PS-341對MUTZ-1細胞Bcl-2家族蛋白Bcl-2，Mcl-1

4、和Bax蛋白表達的影響。 6.采用MTT比色法檢測PS-341作用下，MUTZ-1細胞株對三氧化二砷的敏感性交化。 結(jié)果： 1.PS-341抑制MUTZ-1細胞的生長，呈濃度和時間依賴性： MTT比色法檢測結(jié)果顯示，0～160 ng/ml PS-341處理MUTZ-1細胞24小時、48小時、72小時，能夠明顯抑制MUTZ-1細胞增殖，各組間差異顯著(P值均小于0.01)。且生長抑制率與藥物作用濃度呈正相

5、關(guān)(P<0.01)。PS-341處理細胞24小時、48小時、72小時后，MUTZ-1的IC50分別各為56.1ng/ml；34.2ng/ml；24.3ng/ml. 2.PS-341誘導MUTZ-1細胞凋亡，呈濃度依賴性： 采用瑞氏-姬姆薩染色，油鏡下觀察PS-341作用前后MUTZ-1細胞形態(tài)學變化，結(jié)果顯示，20～80ng/ml的PS-341處理24小時后，MUTZ-1細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學特征，如胞漿空泡化，細胞體

6、積縮小，細胞核染色質(zhì)凝聚、邊緣化，形成新月型核或環(huán)形核，細胞核碎裂，凋亡小體形成等。以流式細胞分析技術(shù)研究了細胞DNA含量及磷脂酰絲氨酸(PS)轉(zhuǎn)位。PI的DNA染色結(jié)果顯示，0～80ng/ml的PS-341作用24小時，AnnexinⅤ-PI雙標記法結(jié)果顯示：以PS-341不同濃度20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml處理MUTZ-1細胞24小時，結(jié)果顯示，0～80ng/ml的PS-341處理MUTZ-1細胞24小時，早期凋亡

7、細胞百分數(shù)分別為：15.3％，21.8％，35.4％(空白對照組為2.3％)，晚期凋亡細胞百分數(shù)分別為：20.4％，30.3％，36.7％，早期細胞凋亡率與藥物作用濃度呈正相關(guān)(r=0.986，P<0.01)。 3.PS-341誘導Caspase-3依賴型MDS細胞凋亡： 20～80ng/mlPS-341作用MUTZ-1細胞12小時后，Caspase-3和PARP蛋白都出現(xiàn)明顯的激活帶，光密度掃描顯示，Caspase-3

8、和PARP蛋白激活帶表達水平與PS-341作用濃度存在正相關(guān)。提示PS-341通過激活Caspase-3途徑誘導MDS細胞凋亡。 4.PS-341通過影響B(tài)cl-2家族蛋白Bcl-2、Mcl-1和Bax蛋白的表達誘導MDS細胞凋亡： 20～80ng/ml PS-341作用MUTZ-1細胞12小時后，Bcl-2、Mcl-1表達水平顯著下調(diào)，Bax表達水平上調(diào)，光密度掃描示，Bcl-2、Mcl-1的蛋白表達水平與PS-341

9、作用濃度存在負相關(guān)，Bax蛋白表達水平與PS-341作用濃度呈正相關(guān)，提示PS-341可能通過改變Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表達比例，促使細胞色素C等多種凋亡因子的釋放，誘導MDS細胞凋亡。 5.PS-341增強MUTZ-1細胞對三氧化二砷的敏感性： 分別單獨及聯(lián)合以PS-3410～80ng/ml，As2O30.25～2μmol/L處理MUTZ-1細胞24小時，MTT比色法測定抑制率。結(jié)果顯示，在一定濃度

10、范圍內(nèi)，PS-341與As2O3聯(lián)用效果優(yōu)于單用，且細胞抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)。 小結(jié)： 1.在體外，PS-341可直接抑制MDS細胞株MUTZ-1細胞的生長，并呈濃度和時間依賴性； 2.20～80ng/ml PS-341處理一定時間后可明顯誘導MUTZ-1細胞凋亡，并呈濃度依賴性； 3.PS-341誘導Caspase-3依賴型MDS細胞凋亡，并呈濃度依賴性。 4.PS-341能下調(diào)Bcl-2和