沙眼衣原體高分辨率溶解曲線基因分型方法的建立及其在男男性行為者流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用.pdf

1、沙眼衣原體（Chlamydiatrachomatis，CT）分15種血清型，其中A～C型是引起沙眼的主要病原體，D～K型主要引起泌尿生殖道感染，L1～L3型可以經(jīng)性接觸傳播發(fā)生系統(tǒng)性感染而導(dǎo)致性病性淋巴肉芽腫(LymphogranulomaVenereum，LGV)。大部分的CT感染沒有臨床癥狀，但感染可持續(xù)存在并引起一系列女性、男性和新生兒的臨床疾病和后遺癥。LGV累及生殖器、肛門、直腸及淋巴結(jié)等，導(dǎo)致潰瘍、膿腫和瘺管的發(fā)生，晚期可引

2、起外生殖器橡皮腫、攣縮性瘢痕和直腸狹窄等嚴(yán)重后遺癥。
　　 CT是目前世界范圍內(nèi)引起性傳播感染的最常見的病原體，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，每年全球新感染的CT感染病例數(shù)約為9200萬(wàn)例。CT感染在許多發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)超過(guò)淋病居所有STI的首位。LGV常見于熱帶和亞熱帶地區(qū)，但自2003年底來(lái)在歐洲和北美等國(guó)家的男男性行為人群(Menwhohavesexwithmen，MSM)中發(fā)生了爆發(fā)流行。我國(guó)90年代后報(bào)道的LGV疑似病例大多由于缺乏

3、有效地實(shí)驗(yàn)室診斷手段未得到確診。
　　 目前的CT基因分型技術(shù)已經(jīng)由建立在主要外膜蛋白(Majoroutermembraneprotein，MOMP)單克隆抗體基礎(chǔ)上的血清學(xué)分型發(fā)展到建立在CT的ompA基因擴(kuò)增基礎(chǔ)上的基因分型。但這些分型方法都需額外步驟的PCR后分析，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)和容易污染，不適于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查和LGV的臨床診斷。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(RT-PCR)已經(jīng)應(yīng)用到了CT基因分型研究，但主要是針對(duì)LGV型別，

4、而且Taqman探針的價(jià)格高，易分解，限制了其在流行病學(xué)中的應(yīng)用。
　　 CT的基因分型研究有助于更好的了解不同基因型別的流行動(dòng)態(tài)，地區(qū)和人群分布特征；有利于性傳播網(wǎng)絡(luò)的研究；了解感染和并發(fā)癥發(fā)生的機(jī)制；同時(shí)為CT疫苗的研究奠定基礎(chǔ)；CT基因分型還可作為診斷LGV的重要實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)。MSM人群中CT感染的分子流行病學(xué)研究目前我國(guó)尚未見報(bào)道，此人群中LGV的流行情況尚缺乏基線資料。本研究的目的是建立一種高效、快捷、穩(wěn)定的CT基因

5、分型方法，并應(yīng)用于MSM人群中CT感染的分子流行病學(xué)研究。
　　 第一部分，沙眼衣原體ompA基因序列的分析和目的擴(kuò)增片段的確定
　　 OmpA基因在CT內(nèi)是單拷貝的，主要編碼MOMP蛋白的氨基酸序列，總長(zhǎng)度約1.1kb左右，包括4個(gè)可變區(qū)（variablesegment，VS）和5個(gè)恒定區(qū)(constantsegment，CS)，其中VS區(qū)基因序列編碼MOMP主要抗原決定簇的氨基酸序列，是CT基因分型的基礎(chǔ)。為了篩選適

6、合高分辨率溶解曲線基因分型方法（High-resolutionmeltinganalysis，HRMA）的VS區(qū)域，我們從Genbank獲得15種型別的CT的ompA基因序列，用DNAstar5.0生物信息學(xué)軟件對(duì)ompA基因和4個(gè)VS區(qū)基因序列進(jìn)行分析，初步確定片段最短，各型間離散性最大的VS2區(qū)作為HRMA基因分型的靶分析區(qū)域；然后在對(duì)15個(gè)型別的CT標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ompA基因VS1-VS2區(qū)，進(jìn)一

7、步分析VS區(qū)基因序列；最后通過(guò)對(duì)36株臨床陽(yáng)性標(biāo)本的ompA基因VS1-VS2區(qū)擴(kuò)增和變異性分析，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)檢索的結(jié)果，最終確定VS2區(qū)作為HRMA基因分型的擴(kuò)增和分析片段。
　　 第二部分，沙眼衣原體高分辨率溶解曲線基因分型方法的建立
　　 HRMA是一種全新的DNA擴(kuò)增后分析技術(shù)，配合使用滲透性飽和染料，PCR擴(kuò)增后升高溫度并監(jiān)測(cè)DNA雙鏈解開過(guò)程中熒光強(qiáng)度的變化，得到溶解曲線從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。我們?cè)O(shè)

8、計(jì)了針對(duì)ompA基因VS2區(qū)的通用巢氏RT-PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出11種與性傳播感染相關(guān)的CT的ompA基因VS2區(qū)并運(yùn)用HRMA方法進(jìn)行基因分型，敏感性可達(dá)到每個(gè)反應(yīng)1個(gè)拷貝，與10種泌尿生殖道常見的病原體和共生菌之間無(wú)交叉反應(yīng)；臨床標(biāo)本檢測(cè)顯示其可對(duì)36份質(zhì)粒擴(kuò)增陽(yáng)性的臨床標(biāo)本全部擴(kuò)增并分型，分型結(jié)果與測(cè)序分型結(jié)果一致；創(chuàng)建了11種與性傳播感染相關(guān)的沙眼衣原體的HRMA基因分型的工作流程。與現(xiàn)有的其他基因分型方法相比較，HRMA基因

9、分型方法可在擴(kuò)增后直接通過(guò)軟件的溶解曲線分析和基因掃描分析來(lái)判斷標(biāo)本的基因型，而不需要繁瑣的和額外步驟PCR后處理分析，成本效果性好、快速、簡(jiǎn)單，并且大大減少了污染的幾率；LCGreen飽和染料不僅性質(zhì)穩(wěn)定，易于儲(chǔ)存，而且對(duì)DNA雙鏈分子沒有破壞性，經(jīng)過(guò)HRMA分析后的擴(kuò)增產(chǎn)物仍可進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序等后續(xù)DNA分析。
　　 第三部分，男男性行為人群中沙眼衣原體的分子流行病學(xué)研究
　　 我們以南部沿海的深圳市的MSM

10、人群作為研究對(duì)象，2008年9月至2009年5月對(duì)深圳兩家MSM桑拿浴場(chǎng)的145名MSM進(jìn)行調(diào)查，其中有143人(98.6％)同意參加本研究，由外展工作人員進(jìn)行問卷調(diào)查并現(xiàn)場(chǎng)采集直腸和尿液標(biāo)本。直腸拭子和尿液標(biāo)本進(jìn)行CT和淋球菌檢測(cè)，并對(duì)CT陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行基因分型。結(jié)果顯示人群中直腸CT感染率為24.4％，尿道CT和淋球菌感染率分別為5.3％和1.5％，其中2.5％的MSM直腸和尿道同時(shí)感染CT，沒有檢測(cè)到CT和淋球菌同時(shí)感染的情況；單因