APEC及其PhoP-Q缺失株感染對雛雞腸道AvBD6表達(dá)的影響.pdf

1、禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）被證明不僅能夠感染禽類，還可以感染哺乳動物（包括人），這表明禽致病性大腸桿菌是人獸共患病的潛在病原體。PhoP/Q是APEC中調(diào)控關(guān)鍵毒力因子的重要二元調(diào)控系統(tǒng)，其對APEC誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)防御反應(yīng)起重要作用。禽β-防御素（Avianβ-defensins，AvBDs）抗菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣、作用機(jī)制獨(dú)特，已然成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。禽β-防

2、御素6（AvBD6）在禽類先天宿主防御系統(tǒng)中起重要作用，其在消化道內(nèi)表達(dá)量較高，且抗微生物活性較為廣泛。
　　目前，有關(guān)PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)與機(jī)體內(nèi)防御素的相互作用，尚未見報道。因此，為了探討雛雞在感染APEC及其PhoP/Q缺失株過程中，腸道內(nèi)AvBD6的表達(dá)與分布情況，本研究用APEC及其PhoP/Q缺失株感染14日齡的雛雞（羅曼雞），構(gòu)建感染雛雞腸道模型，并觀察病理變化。菌液感染雛雞后，分別于不同時間點(diǎn)采取各段小腸組織，

3、利用FQ-PCR檢測AvBD6 mRNA在小腸組織的轉(zhuǎn)錄水平，免疫組化技術(shù)檢測AvBD6蛋白在小腸組織的分布規(guī)律。開展本實(shí)驗(yàn)為研究AvBDs在抗APEC感染中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時也為揭示PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)對APEC感染雞后誘導(dǎo)AvBDs抗感染的調(diào)控作用機(jī)理提供理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1. APEC及其PhoP/Q缺失株感染雛雞腸道及其病理變化
　　經(jīng)腿肌分別接種濃度為1×106 cfu/mL的 APEC

4、菌液和APEC PhoP/Q缺失株菌液0.5 mL（空白對照組用PBS代替），分別建立APEC感染雛雞和APEC PhoP/Q缺失株感染雛雞模型，并觀察病理變化。結(jié)果顯示雛雞在接種APEC及其PhoP/Q缺失株48 h時出現(xiàn)典型病變，即腸粘膜腫脹，甚至出現(xiàn)血管破裂出血，形成出血性腸炎。小腸絨毛上皮組織脫落，杯狀細(xì)胞被溶解，絨毛中心軸部位紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞數(shù)量增加。
　　2.雛雞感染APEC及其PhoP/Q缺失株后小腸組織AvBD6

5、mRNA的表達(dá)
　　14日齡的羅曼雞分別接種APEC和APEC PhoP/Q缺失株菌液，于感染后0 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h采集小腸組織（包括十二指腸、空腸和回腸），應(yīng)用FQ-PCR方法檢測雛雞在感染過程中腸道內(nèi)AvBD6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示雛雞感染APEC及其PhoP/Q缺失株24-48 h，小腸各段AvBD6 mRNA表達(dá)量表現(xiàn)為：PhoP/Q缺失株攻毒組>APEC攻毒組>空白對照組；AvB

6、D6 mRNA表達(dá)量于48 h達(dá)到峰值且顯著高于其余各時間段（P<0.05）；空白對照組中雛雞十二指腸和空腸的 AvBD6 mRNA相對表達(dá)量最高，且在0-48 h內(nèi)基本呈水平態(tài)勢；感染0-48 h時，APEC攻毒組雛雞空腸AvBD6 mRNA轉(zhuǎn)錄量相對較高；APEC PhoP/Q缺失株感染雛雞48 h內(nèi)十二指腸AvBD6 mRNA轉(zhuǎn)錄量顯著高于空腸和回腸（P<0.01或P<0.05）。
　　3.雛雞感染APEC及其PhoP/Q缺

7、失株后小腸組織AvBD6蛋白的表達(dá)
　　根據(jù)FQ-PCR的檢測結(jié)果，于感染48 h時采集各組十二指腸、空腸和回腸組織，運(yùn)用免疫組化方法檢測雛雞在感染APEC及其PhoP/Q缺失株時AvBD6在腸道中的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，AvBD6蛋白在各組小腸內(nèi)均有不同程度的分布，在攻毒組雛雞小腸各段的絨毛上皮細(xì)胞和十二指腸中的類十二指腸腺、空腸及回腸的腸腺部分有不同程度的分布。AvBD6蛋白在小腸組織內(nèi)的陽性信號呈棕黃色。利用Image-p

8、ro plus6.0軟件對各組織切片的平均光密度值進(jìn)行檢測，用其代表AvBD6的蛋白相對表達(dá)量，結(jié)果顯示APEC攻毒組和PhoP/Q缺失株攻毒組同腸段AvBD6的蛋白相對表達(dá)量較空白對照組顯著升高（P<0.01或P<0.05）。
　　以上試驗(yàn)結(jié)果表明，14日齡羅曼雛雞在感染APEC及其PhoP/Q缺失株后，AvBD6 mRNA在雞小腸各段的分布和表達(dá)具有一定規(guī)律性，在感染48 h內(nèi)AvBD6 mRNA的表達(dá)水平在48 h時最高，且