攜帶Rab9 cDNA的慢病毒對C型Niemann-Pick病小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：Rab9與NPC1在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的定位研究
　　 目的：
　　 觀察Rab9與NPC1蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的定位及其與溶酶體、高爾基體和晚期內(nèi)體的關(guān)系。
　　 方法：
　　 以小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2為對象，采用特異性識別Rab9、NPC1的抗體和溶酶體、高爾基體、晚期內(nèi)體的特異性表面標(biāo)記進(jìn)行熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　 結(jié)果：<

2、br>　　 Rab9和NPC1共定位于小膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)，Rab9表達(dá)于溶酶體、高爾基體和晚期內(nèi)體。
　　 結(jié)論：
　　 Rab9對NPC1蛋白的正常功能可能有重要影響。
　　 第二部分：利用Lentivector Expression System系統(tǒng)構(gòu)建攜帶Rab9cDNA的重組慢病毒及功能鑒定
　　 目的：
　　 Rab蛋白家族成員通過將囊泡定位在靶細(xì)胞膜上來促進(jìn)囊泡轉(zhuǎn)運。Rab9是Rab家

3、族成員之一，調(diào)節(jié)從晚期內(nèi)體到高爾基網(wǎng)的囊泡轉(zhuǎn)運。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積是C型尼曼-皮克病的一個重要特征，實驗?zāi)康脑谟谔接憣ab9應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)變性病進(jìn)行基因治療的可能性。
　　 方法：
　　 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建pCDH1-MCF1-RAB9-EF1-copGFP表達(dá)質(zhì)粒，然后用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將慢病毒包裝系統(tǒng)的pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G和攜帶目的基因的載體pCDH1-MCF1-RAB9-EF1

4、-copGFP共同轉(zhuǎn)染到293T包裝細(xì)胞內(nèi)包裝病毒,采用包裝成功的病毒感染小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）,72小時后，觀察目的基因（GFP為報告基因）的表達(dá)。同時，將包裝好的病毒注入BalB/c鼠小腦，4周后采用Western-blot檢測Lenti-Rab9的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 凝膠電泳和DNA測序證明Rab9 cDNA成功導(dǎo)入慢病毒載體pCDH1-MCF1-EF1-copGFP，感染小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）72小時

5、后，BV-2細(xì)胞中可見EGFP的表達(dá)。將包裝產(chǎn)生的病毒注入BalB/c鼠小腦，4周后Western-blot分析顯示：BalB/c鼠小腦Rab9表達(dá)明顯升高，證明編碼Rab9 cDNA的慢病毒包裝成功，該病毒能明顯增加Rab9的表達(dá)量。
　　 結(jié)論：
　　 結(jié)果表明攜帶Rab9 cDNA的重組慢病毒包裝獲得成功。該病毒能明顯增加Rab9的表達(dá)，它可能成為一種新的治療神經(jīng)系統(tǒng)變性病的手段。
　　 第三部分：攜帶Ra

6、b9 cDNA的重組慢病毒對C型尼曼-皮克病小鼠行為學(xué)的影響
　　 目的：
　　 觀察雙側(cè)側(cè)腦室注射攜帶Rab9 cDNA的重組慢病毒(Lentivirus)對C型尼曼-皮克?。∟PC）小鼠體重及行為學(xué)的影響。
　　 方法：
　　 生后三天內(nèi)npc-/-小鼠經(jīng)雙側(cè)側(cè)腦室注射攜帶Rab9 cDNA的Lentivirus，動態(tài)測量小鼠體重，并采用衣架懸掛試驗及足印試驗評估小鼠4到8周的運動能力。
　　

7、 結(jié)果：
　　 ① Lenti-Rab9組雌性小鼠體重減輕明顯延緩。
　　 ②衣架懸掛試驗顯示Lenti-Rab9組小鼠運動能力明顯改善。
　　 ③足印試驗顯示Lenti-Rab9組相對步距（68.1%±3.8%）與對照病毒組(35.7%±8.1%)及非手術(shù)組（40.2%±4.8%）相比明顯增加。
　　 結(jié)論：
　　 雙側(cè)側(cè)腦室注射攜帶Rab9 cDNA的Lentivirus改善了npc-/-小鼠

8、的行為學(xué)，延緩了雌性小鼠體重的減輕，有可能為NPC的治療提供新的有效途徑。
　　 第四部分：攜帶Rab9 cDNA的慢病毒對C型尼曼-皮克病小鼠神經(jīng)病理的影響
　　 目的：
　　 觀察npc-/-小鼠生后三天內(nèi)經(jīng)雙側(cè)側(cè)腦室注射攜帶Rab9 cDNA的Lentivirus對C型尼曼-皮克病（NPC）小鼠神經(jīng)病理的影響。
　　 方法；
　　 ①經(jīng)雙側(cè)側(cè)腦室途徑給生后三天內(nèi)的npc-/-小鼠注射攜帶Ra

9、b9 cDNA的Lentivirus。
　　 ②通過HE染色、免疫組織化學(xué)及免疫印跡方法評估病毒注射后的npc-/-小鼠的神經(jīng)病理變化。
　　 結(jié)果：
　　 ①攜帶Rab9 cDNA的Lentivirus能廣泛感染npc-/-小鼠，介導(dǎo)Rab9在腦中表達(dá)。
　　 ②攜帶Rab9 cDNA的Lentivirus明顯延緩浦肯野細(xì)胞的脫失、減少npc-/-小鼠軸突球狀體的數(shù)量。
　　 ③攜帶Rab9 c