人多發(fā)性骨髓瘤脂肪酸合成酶的表達(dá)和作為治療靶位的分子機(jī)制研究.pdf

1、人多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種起源于B淋巴細(xì)胞的漿細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤,多發(fā)于中老年人,隨著我國人口的老齡化其發(fā)病率逐年增高.標(biāo)準(zhǔn)劑量化療對(duì)MM緩解率低,因腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥,緩解后短期內(nèi)復(fù)發(fā)率高;雖然大劑量化療聯(lián)合造血干細(xì)胞移植其完全緩解率可由5﹪升至50﹪,但由于大劑量化療后的耐藥殘余腫瘤細(xì)胞影響預(yù)后,其遠(yuǎn)期效果改善不明顯.因此,探索新的人多發(fā)性骨髓瘤的治療策略非常必要.脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAs)是

2、一種腫瘤代謝性標(biāo)志抗原,或稱之為一種"代謝癌基因".腫瘤細(xì)胞通過激活這種"代謝癌基因"--腫瘤相關(guān)性脂肪酸合成酶的過度表達(dá)體現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞生長優(yōu)勢.本研究分四個(gè)部分對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤"代謝癌基因"--脂肪酸合成酶的表達(dá)狀態(tài)和作為治療靶位的分子機(jī)制方面作了研究. 一、脂肪酸合成酶在人多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)研究用免疫組織化學(xué)檢測,27例人多發(fā)性骨髓瘤骨髓標(biāo)本中,有19例在骨髓涂片上可見骨髓瘤細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒,為脂肪酸合成酶表達(dá)陽性

3、細(xì)胞.占檢測標(biāo)本的70.37﹪,而缺鐵性貧血骨髓涂片,脂肪酸合成酶表達(dá)陰性: 用RT-PCR檢測人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系U266,RPM18226,人多發(fā)性骨髓瘤骨髓標(biāo)本和健康獻(xiàn)血員PBMNCs中FAS的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn),人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系U266,RPM18226均有FAS mRNA的表達(dá), 27例人多發(fā)性骨髓瘤骨髓標(biāo)本,有22例有FAS mRNA表達(dá),占檢測標(biāo)本的81.48﹪;而健康獻(xiàn)血員外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNCs)中不表達(dá)FAS m

4、RNA;用免疫印跡法(western Blot)檢測人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系,臨床多發(fā)性骨髓瘤骨髓標(biāo)本脂肪酸合成酶表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn),人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系U266,RPM18226均有FAS蛋白水平的表達(dá),27例人多發(fā)性骨髓瘤骨髓標(biāo)本有16例有不同程度的FAS表達(dá),占檢測標(biāo)本數(shù)的59.25﹪.而健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNCs)不表達(dá)FAS.我們認(rèn)為高表達(dá)脂肪酸合成酶的MM可以作為MM的一種表型(Phenotype),可能是一個(gè)非常重要的潛在

5、的治療靶點(diǎn). 二、脂肪酸合成酶抑制劑淺藍(lán)菌素體外抗人多發(fā)性骨髓瘤作用的研究我們以U266骨髓瘤細(xì)胞為模型,用MTT法檢測了淺藍(lán)菌素在體外對(duì)U266細(xì)胞的增殖抑制作用,發(fā)現(xiàn)20ug/ml終濃度的淺藍(lán)菌素即能明顯抑制U266細(xì)胞的增殖,并呈劑量依賴性.為進(jìn)一步了解淺藍(lán)菌素抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制,我們用流式細(xì)胞儀技術(shù)進(jìn)行了細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期DNA分析,結(jié)果表明淺藍(lán)菌素抑制U266細(xì)胞增殖的機(jī)制是導(dǎo)致了細(xì)胞早期凋亡增加,20ug/ml

6、的cerulenin作用于U266細(xì)胞12h,細(xì)胞早期凋亡率為56.9﹪,晚期凋亡率為3.2﹪, 24h細(xì)胞早期凋亡率為69.3﹪,晚期凋亡率為17.6﹪,而對(duì)照組為4.3﹪和1.8﹪.細(xì)胞周期DNA分析發(fā)現(xiàn)20ug/ml的cerulenin作用于U266 12h,S期從對(duì)照組的9.7﹪上升至20.3﹪,24h時(shí)S期為29.8﹪,因此,淺藍(lán)菌素可使U266細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在S期,從而減少進(jìn)入G-M期細(xì)胞數(shù),減少細(xì)胞有絲分裂,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)

7、生凋亡.本研究結(jié)果提示,脂肪酸合成酶抑制劑在體外可通過促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡抑制人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖,有望成為我們治療MM的又一新方法和新途徑. 三、 SuperArray cDNA基因芯片研究淺藍(lán)菌素改變多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)為進(jìn)一步明確cerulenin引起MM細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,我們用SuperArraycDNA基因芯片研究了淺藍(lán)菌素改變多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)譜.20ug/ml淺藍(lán)菌素處理U26

8、6細(xì)胞12h后,與空白組對(duì)照,在研究的96個(gè)基因中,共有44個(gè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)改變較明顯,其中表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因41個(gè),包括細(xì)胞外凋亡通路中TNF受體和配體家族的多個(gè)成員基因DR3DR5,OX40,CD4.0,HVEM-L,CD30L,4-1BB-L,TNFR2,TNFRSF14表達(dá)上調(diào),與其相關(guān)的死亡域和死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因DAPK2,MyD88,CIDE-A,CIDE-B表達(dá)上調(diào),對(duì)細(xì)胞內(nèi)通路有重要調(diào)節(jié)作用的Bcl-2家族成員

9、Bcl-w,Bik,Nip3,HRK,MCL-1基因的表達(dá)上調(diào),Caspase9基因表達(dá)上調(diào)達(dá)43倍,Apafl,Caspase3等基因也明顯上調(diào);有3個(gè)基因TNFB/LT, CD40L,TRAF2表達(dá)下調(diào)2倍以上.結(jié)果標(biāo)明,淺藍(lán)菌素引起U266細(xì)胞的凋亡有死亡受體信號(hào)通路和死亡受體非依賴的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同參與,有多個(gè)與凋亡相關(guān)的家族的多個(gè)基因成員表達(dá)發(fā)生了變化,Caspase 9表達(dá)的顯著上調(diào),說明線粒體途徑在凋亡中起了主要作用,TRAF

10、2基因表達(dá)的變化提示著細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子參與了淺藍(lán)菌素引起U266細(xì)胞的凋亡,其確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究. 四、天然藥物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和淺藍(lán)菌素抗人多發(fā)性骨髓瘤作用及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)譜的差異性比較綠茶提取物--表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin galIate,EGCG)處理不同的腫瘤細(xì)胞系,均顯示有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效應(yīng),有學(xué)者認(rèn)為它的抗腫瘤作用與它有強(qiáng)大的抑制脂肪酸合成

11、酶的功能相關(guān). 本部分研究對(duì)天然藥物EGCG抑制人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖及誘發(fā)凋亡作用及機(jī)制進(jìn)行研究,并用SuperArrav cDNA基因芯片對(duì)EGGG和淺藍(lán)菌素抗人多發(fā)性骨髓瘤作用及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)譜進(jìn)行比較,我們用MTT法檢測了EGCG在體外對(duì)U266細(xì)胞的增殖抑制作用,發(fā)現(xiàn)50ug/mI終濃度的EGCG即能明顯抑制U266的增殖,并呈劑量依賴性.為進(jìn)一步了解EGCG抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制,我們用流式細(xì)胞儀技術(shù)進(jìn)行了

12、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期DNA分析,結(jié)果表明EGCG抑制U266細(xì)胞增殖的機(jī)制是導(dǎo)致了細(xì)胞晚期凋亡增加,而淺藍(lán)菌素處理U266細(xì)胞相同時(shí)間后,U266細(xì)胞的凋亡以早期凋亡為主.SuperArray cDNA基因芯片研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),U266經(jīng)EGCG處理后,與凋亡相關(guān)的96個(gè)基因中共有56個(gè)基因發(fā)生表達(dá)變化,其中有51個(gè)基因表達(dá)上調(diào)2倍以上,有5個(gè)基因表達(dá)下調(diào)2倍以上:在表達(dá)上調(diào)的基因中淺藍(lán)菌素組和EGCG組均上調(diào)的基因有31個(gè),其中26個(gè)基因表

13、達(dá)幅度相近,而有4個(gè)基因上調(diào)幅度有較大差異,Caspase 9、Myd88在淺藍(lán)菌素組表達(dá)上調(diào)水平與EGCG組比較差異在2倍以上,Nip3、Casper(CFLAR)在EGCG組表達(dá)上調(diào)水平與淺藍(lán)菌素組比較差異在2倍以上;在淺藍(lán)菌素組表達(dá)上調(diào)而在EGCG組表達(dá)無變化的基因有6個(gè),為Bnice、CRADD、DFF40(CAD)、GADD45、MdM2、TNFA;在EGCG組表達(dá)上調(diào)而在淺藍(lán)菌素組表達(dá)無變化的基因有5個(gè),為BAx、4-lBB

14、、Trail、TNFSF-11、TRAF6.研究結(jié)果表明,EGGG和淺藍(lán)菌素引起U266細(xì)胞凋亡均有死亡受體信號(hào)通路和死亡受體非依賴的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同參與,其中有多個(gè)與凋亡相關(guān)的家族的多個(gè)基因成員表達(dá)發(fā)生變化,但兩者在引起凋亡的時(shí)間、強(qiáng)度和分子機(jī)制上存在一定差異. 1.脂肪酸合成酶在人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226、U266中高表達(dá),多數(shù)臨床標(biāo)本有不同程度的脂肪酸合成酶表達(dá). 2.脂肪酸合成酶抑制劑在體外可抑制人多發(fā)性骨

15、髓瘤細(xì)胞增殖,有望成為我們治療MM的又一新方法和新途徑. 3.淺藍(lán)菌素引起 U266細(xì)胞的凋亡有死亡受體信號(hào)通路和死亡受體非依賴的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同參與,線粒體途徑在凋亡中起了主要作用,細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子可能參與了淺藍(lán)菌素引起U266細(xì)胞的凋亡. 4.EGCG和淺藍(lán)菌素引起U266細(xì)胞凋亡過程中有多個(gè)與凋亡相關(guān)的家族的多個(gè)基因成員表達(dá)發(fā)生相似變化,但兩者在引起凋亡的時(shí)間、強(qiáng)度和分子機(jī)制上存在一定差異,EGCG的抗多發(fā)性骨髓瘤可能