香葉木苷調(diào)控血栓靶蛋白的研究.pdf

1、香葉木苷是從中藥蓬子菜中提取出的黃酮苷類化合物,該藥在抑制癌細(xì)胞增殖、降低出血及疼痛方面效果顯著,并且對(duì)于輻射引起的氧化損傷有很好的修復(fù)作用,目前研究較多的是其在靜脈血栓方面的顯著作用,香葉木苷已被確定為抗血栓的藥效物質(zhì)。本研究通過(guò)分析香葉木苷作用于靜脈血栓而引起的差異靶蛋白,選擇其中顯著變化的蛋白點(diǎn),再以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象,構(gòu)建敏感蛋白CEP350的siRNA重組體,獲得干擾蛋白穩(wěn)定表達(dá)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株,并檢測(cè)該目的基因的表達(dá)

2、情況。
　　本研究首先在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上以對(duì)照組、模型組和預(yù)防組Wistar大鼠的試劑盒純化血液蛋白為研究對(duì)象,采用雙向電泳,經(jīng)PDquest軟件進(jìn)行分析,尋找其中差異表達(dá)的蛋白。雙向電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果中一共有307個(gè)蛋白表達(dá),其中預(yù)防組表達(dá)了所有蛋白,模型組表達(dá)的蛋白點(diǎn)為91個(gè),只在預(yù)防組中表達(dá)的蛋白點(diǎn)有137,與模型組比較2倍上調(diào)的蛋白點(diǎn)有32個(gè),2倍下調(diào)的蛋白有12個(gè),選取10個(gè)差異的蛋白點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜分析,

3、鑒定了50個(gè)蛋白點(diǎn),其中包括3個(gè)未知蛋白。
　　以前期差異顯著的蛋白CEP350為目標(biāo)蛋白,進(jìn)行RNAi干擾,將干擾細(xì)胞和正常細(xì)胞用紅色微管探針染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察其紡錘體的變化,同時(shí)對(duì)干擾細(xì)胞提取RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和qPCR,以檢測(cè)目的基因的表達(dá),確定沉默效率。在激光共聚焦顯微鏡下觀察微管及紡錘體的變化,發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞近球形、微管規(guī)則分布相比,干擾組的細(xì)胞微管呈放射狀,紡錘體的數(shù)目減少,分布雜亂。RNAi干擾使CEP3