舌癌患者自體CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其免疫活性的研究.pdf

1、過去幾十余年腫瘤免疫研究取得很大成就，已初步闡明腫瘤免疫的主要機(jī)制，為各項(xiàng)研究的深入開展創(chuàng)造了條件。在這段時(shí)間里，先后發(fā)現(xiàn)了多種具有抗腫瘤活性的效應(yīng)細(xì)胞，如LAK、TIL、CIL等。但這些效應(yīng)細(xì)胞都有各自的局限性，LAK細(xì)胞抗腫瘤活性的維持依賴于高濃度外源性IL-2，臨床應(yīng)用受到一定限制。TIL和CIL雖然對(duì)腫瘤有特異性殺傷作用，但能活得的細(xì)胞數(shù)量有限。CIK屬新型有高度體外擴(kuò)增能力非MHC限制性的腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，已有實(shí)驗(yàn)證明CIK比其他

2、類型免疫細(xì)胞有更強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)多種腫瘤類型均有殺傷作用，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部惡性腫瘤中最常見的組織類型。統(tǒng)計(jì)資料顯示，在我國(guó)，舌癌占口腔癌構(gòu)成比的30％-50％，發(fā)病率為0.4-0.6/10萬，每年都有大量的新增病例。舌鱗癌具有獨(dú)特的生物學(xué)行為，腫瘤侵襲能力強(qiáng)，容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。中晚期舌癌治療的難度大，臨床強(qiáng)調(diào)采用綜合治療，除了手術(shù)、放療和化療以外，腫瘤的生物治療日益受到重視，與舌癌有關(guān)的細(xì)胞免疫研究正逐步開

3、展。本實(shí)驗(yàn)將初步探討舌癌患者自體CIK細(xì)胞對(duì)人舌癌細(xì)胞系Tca8113的抗腫瘤活性。 目的： ①分別探討舌癌患者及正常人外周血CIK細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞表型、和對(duì)Tca8113細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。 ②觀察CIK細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中分泌的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)等含量的變化。 ③研究舌癌患者LAK細(xì)胞、CD3AK細(xì)胞增殖能力、和對(duì)Tca81

4、13細(xì)胞的細(xì)胞毒作用并與舌癌患者自體CIK細(xì)胞作比較。 ④為尋求舌癌患者自體CIK細(xì)胞對(duì)舌癌過繼免疫治療的新途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 提取20例舌癌患者和20例健康捐獻(xiàn)者的外周血，經(jīng)密度梯度離心分離外周血單核細(xì)胞，即提取外周血單核細(xì)胞中非貼壁細(xì)胞用含10％人AB型血清的RPM11640懸浮細(xì)胞，加入IFN-γ，培養(yǎng)24小時(shí)后轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗CD3mAb包被的培養(yǎng)瓶，加入IL-2和IL-1βB共同培養(yǎng)誘導(dǎo)CIK細(xì)胞，定

5、期換液，培養(yǎng)過程中進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)，了解細(xì)胞擴(kuò)增能力； ①流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞動(dòng)態(tài)表型特征，用MTT法檢測(cè)各效應(yīng)細(xì)胞對(duì)舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113的殺傷活性； ②分別取不同時(shí)段CIK細(xì)胞的培養(yǎng)上清液0.5ml，用酶聯(lián)免疫的方法檢測(cè)其培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2、TNF-α的含量變化； ③同時(shí)培養(yǎng)舌癌患者LAK細(xì)胞、CD3AK細(xì)胞并與舌癌患者CIK細(xì)胞在增殖能力和對(duì)Tca8113殺傷活性上作比較。資

6、料用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果： 舌癌患者20ml外周血經(jīng)過一個(gè)周期培養(yǎng)平均獲得的CIK細(xì)胞數(shù)低于健康對(duì)照組(P<0.05)，但舌癌患者CIK細(xì)胞經(jīng)過周期培養(yǎng)也較培養(yǎng)前的數(shù)量明顯增高，于12-21d達(dá)高峰。 ① CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程中其上清液IL-2、TNF-α、INF-γ含量隨時(shí)間增長(zhǎng)而升高，至2周左右達(dá)最高峰，隨后有下降趨勢(shì)，表明CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中其自身可以分

7、泌多種具有抗腫瘤作用的細(xì)胞因子，從而間接反映CIK細(xì)胞在體外培養(yǎng)2周左右具有較大生物學(xué)活性；②舌癌患者CIK細(xì)胞與同體來源的LAK細(xì)胞相比細(xì)胞增殖倍數(shù)和殺傷活性均明顯提高(P<0.05)。舌癌患者CIK細(xì)胞與舌癌患者CD3AK相比細(xì)胞增殖倍數(shù)早期無明顯差異但后期增殖倍數(shù)及殺傷活性有顯著提高(P<0.05)。 結(jié)論： 人舌癌患者外周血懸浮生長(zhǎng)的單核細(xì)胞經(jīng)IFN-γ、抗CD3mAb、IL-2和IL-1β等細(xì)胞因子序列誘導(dǎo)后可

8、大量擴(kuò)增富含CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的CIK異質(zhì)細(xì)胞群，培養(yǎng)后明顯提高CIK細(xì)胞中CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的比例(P<0.05)，CD3+、CD3+CD8+細(xì)胞也較培養(yǎng)前顯著增加(P<0.05)，而CD3+CD4+和CD3-CDs6+的百分率則明顯下降。 ①CIK細(xì)胞可分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子，且在培養(yǎng)2周左右時(shí)量最大，提示此時(shí)CIK細(xì)胞具有較大生物學(xué)活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CIK細(xì)胞可能通過其自身分泌I