人食管下括約肌套索纖維和鉤狀纖維中肝磷酯對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響以及1，4，5-三磷酸肌醇受體的表達(dá).pdf

1、目的:人食管下括約肌(LES)是食管胃接合部(esophagogastric junction,EGJ)特殊增厚的一簇肌肉組織。20世紀(jì)70年代,Liebermann-Meffert等提出LES由套索纖維(sling fibers)和鉤狀纖維(clasp fibers)共同構(gòu)成。這兩束肌纖維與膈腳協(xié)同作用以維持食管下括約肌的正常關(guān)閉狀態(tài),并在食管胃接合部形成食管下括約肌高壓帶。正常狀態(tài)下,此高壓帶可防止胃內(nèi)容物反流入食管,并且在適當(dāng)?shù)臅r

2、候降低壓力以允許食管內(nèi)食團(tuán)下行入胃,或使胃內(nèi)液體或氣體排出。食管下括約肌功能的維持主要依賴神經(jīng)體液因素以及食管下括約肌自身肌源因素等共同調(diào)節(jié),以保障吞咽舒張的同時起到抗反流的作用。鈣離子(Ca2+)對食管下括約肌的收縮功能也起到很關(guān)鍵的作用。根據(jù)我們先前的體外實驗證明,在相同乙酰膽堿(Ach)濃度(10-8mol/L)作用時套索纖維對Ach的敏感性更高;在Ach作用、引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]I)升高的變化時,鉤狀纖維[Ca2+

3、]I的變化主要是因為L-Ca通道引起的Ca2+內(nèi)流引起,而套索纖維[Ca2+]I的變化主要是因為細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放引起。三磷酸肌醇(IP3)作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的第二信使可與三磷酸肌醇受體(IP3R)特異性結(jié)合,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)存儲的鈣離子釋放,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子濃度升高。目前公認(rèn)的存在3種IP3R亞型,即IP3R1、IP3R2、IP3R3。動物及人類部分細(xì)胞研究結(jié)果表明,IP3R的3種亞型即便是在同一生命體中,因組織和細(xì)胞類

4、型的不同而分布不同且功能存在差異。目前針對1,4,5.三磷酸肌醇受體(1,4,5-IP3R)不同亞型(IP3R1、IP3R2、IP3R3)對食管下括約肌功能研究的中外文獻(xiàn)并無記載。本實驗采用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)成像和蛋白印跡(Western-blot)兩種方法,探討IP3R的3種亞型在人食管下括約肌中的表達(dá)情況,并以食管環(huán)行肌(E)和胃底環(huán)行肌(G)與套索纖維(S)、鉤狀纖維(C)中受體蛋白的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行對比,為進(jìn)一步研究三磷酸

5、肌醇受體在人食管下括約肌收縮調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ),更為完善地闡述人食管下括約肌收縮功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 方法:
　　 1選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2009年3月到2010年2月因中高位食管癌行食管大部切除術(shù)患者共31例。手術(shù)室采集新鮮胃食管連接部標(biāo)本,銳性剝?nèi)ノ纲S門部及食管下段的粘膜層及粘膜下層后,制備套索纖維(S)、鉤狀纖維(C)、食管體部環(huán)行肌(E)和胃底環(huán)行肌(G)的肌條。
　　 2將取得的套索纖維(S

6、)和鉤狀纖維(C)標(biāo)本以酶解的方法制備成單細(xì)胞懸液,以Fluo-3/AM負(fù)載稀釋后各平均分成兩份等量的細(xì)胞懸液平鋪在共聚焦專用小平皿的中央玻片上,實驗組標(biāo)本中加入一定量的皂角苷(saponin)溶液、肝磷酯(heparin)溶液,對照組則為相同劑量的無鈣緩沖液、heparin溶液,共聚焦顯微鏡掃描兩組標(biāo)本后分別加入一定量的Ach溶液,5s后再次掃描并記錄同一單細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度。
　　 3以膜蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒提取受體蛋

7、白,BCA法蛋白定量,配平蛋白至相同濃度與體積后,應(yīng)用電泳儀電泳,分離出3種IP3R受體亞型分子量大小相應(yīng)的蛋白后轉(zhuǎn)膜,最后應(yīng)用IP3R受體亞型抗體行暗室發(fā)光與曝光檢測目的蛋白的表達(dá),并分析其條帶灰度值(IOD)。
　　 結(jié)果:
　　 1激光共聚焦顯微鏡成像實驗組細(xì)胞熒光強(qiáng)度在加入Ach后增高均不明顯(S8.29±5.03,C12.98±6.24),而對照組在加入.Ach后鈣離子熒光強(qiáng)度明顯增高(S37.50±15.03

8、,C28.49±6.57);在加入Ach前后,套索纖維和鉤狀纖維兩組細(xì)胞的實驗組與對照組比較均有顯著差異,存在統(tǒng)計學(xué)意義(ts=11.944,tc=4.84,p=0.00)。
　　 2 Western blot存在至少2種IP3R受體亞型有其相應(yīng)蛋白條帶的表達(dá):一種是IP3R1,可顯影于膜蛋白與胞漿蛋白,在C、S、E、G四個部位的灰度值分別為9118.11±4733.73,8665.15±3197.56,8597.43±3624

9、.52,9013.00±5058.29;另一種極有可能是IP3R3,主要顯影于胞漿蛋白,在C、S、E、G四個部位的灰度值分別為20686.58±9478.28,20016.14±7764.18,11200.29±10381.24,11817.99±10498.55;鉤狀纖維(C)和套索纖維(S)中兩種受體亞型在表達(dá)量有統(tǒng)計學(xué)差異(Fc=16.543,Fs=29.628,p=0.00),食管平滑肌(E)和胃底平滑肌(G)的表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差

10、異(FE=1.139,p=0.309;FG=1.105,p=0.336)。
　　 結(jié)論:
　　 1 IP3R的特異性拮抗劑肝磷酯(heparin)可降低乙酰膽堿(Ach)觸發(fā)的收縮時LES套索纖維和鉤狀纖維細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,也從側(cè)面證明了人LES單細(xì)胞內(nèi)IP3R的存在且其功能為影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度;
　　 2鉤狀纖維和套索纖維中至少存在2種IP3R受體亞型:一種是IP3R1,存在于細(xì)胞膜與胞漿,表達(dá)量較低;另一種