siDrosha穩(wěn)定細(xì)胞系的建立以及miR491-5p誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的研究.pdf

1、碩士學(xué)位論文(專(zhuān)業(yè)學(xué)位)siDrosha穩(wěn)定細(xì)胞系的建立以及miR491—5p誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的研究所院：姓名：指導(dǎo)教師：j日寸形(J，：學(xué)科專(zhuān)業(yè)：研究方向：完成日期：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所郭蓉劉力病原生物學(xué)基因表達(dá)調(diào)控2012年5月北京協(xié)利醫(yī)。T一]，a、t碩一卜學(xué)何論文中文摘要MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)隸屬于非編碼RNA(non—codingRNA)大家族并可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的

2、重要小分子，長(zhǎng)度為21～23個(gè)核苷酸，可以通過(guò)誘發(fā)mRNA降解或抑制蛋白翻譯的方式負(fù)調(diào)控靶基因。到目前為止，在人類(lèi)基因組中已經(jīng)確定的miRNA有650個(gè)以上，它們參與調(diào)控人類(lèi)30％的蛋白表達(dá)。miRNA分子參與了包括發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、代謝和癌癥等多種生理病理過(guò)程?；趍iRNA的重要功能，近年來(lái)對(duì)miRNA的功能研究己成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。在miRNA的生物合成過(guò)程中，Drosha酶起到了非常重要的作用，它是RNaselII家

3、族的成員，介導(dǎo)從primiRNA到～70ntpre—miRNA的加工過(guò)程。Drosha基因突變后，將會(huì)影響miRNA的『F常生物合成，因此，建立Drosha基因突變細(xì)胞模型，有助于研究一些miRNA的生物學(xué)功能。本課題第一部分利用RNAi實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建了293一siDrosha穩(wěn)定細(xì)胞系，并探討該穩(wěn)定細(xì)胞系在miRNAs功能研究中的應(yīng)用。具體研究如下：(1)將質(zhì)粒pSicoRhumanDroshal轉(zhuǎn)入人胚腎293細(xì)胞，用G418篩選2—

4、3周后，獲得293siDrosha#3穩(wěn)定細(xì)胞系。(2)用RTPCR、Westernblotting、real—timePCR等方法檢測(cè)293一siDrosha#3穩(wěn)定細(xì)胞系中Drosha基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況。(3)用poly(A)實(shí)時(shí)定量RTPCR方法檢測(cè)野生型293細(xì)胞，Mix細(xì)胞(未克隆的293一siDrosha細(xì)胞)，293siDmsha#3細(xì)胞(克隆的293一siDrosha細(xì)胞)中內(nèi)源hsa—miR4915p的表達(dá)情

5、況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)構(gòu)建的293siDrosha#3穩(wěn)定細(xì)胞系與對(duì)照組相比，293siDrosha#3細(xì)胞中Drosha基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著下降。(2)通過(guò)檢測(cè)內(nèi)源性hsamiR4915p在對(duì)照組和293一siDrosha#3細(xì)胞中表達(dá)情況，表明對(duì)照組細(xì)胞中表達(dá)的hsamiR4915p是293siDrosha#3細(xì)胞的近120倍。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了293siDrosha穩(wěn)定細(xì)胞系，并且證明此穩(wěn)定細(xì)胞系可以作為研究一些

6、microRNAs相關(guān)功能的模式細(xì)胞系。因?yàn)閙iRNA可以調(diào)控人類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育、生理、病理狀態(tài)，因此體液中廣泛存在的miRNA可能作為研究人類(lèi)生理和疾病狀態(tài)的新的有效生物標(biāo)志物。已經(jīng)有研究表明在正常組織與病理組織中miRNA表達(dá)水平存在差異，即使是同一組織不同的分化時(shí)期，miRNA表達(dá)水平也不相同。這種差異表達(dá)也發(fā)生在腫瘤特異性miRNA上，從而幫助診斷腫瘤的組織來(lái)源和特定的腫瘤分型。研究表明miRNA對(duì)正常細(xì)胞的增殖有促進(jìn)或抑制作用，因