MicroRNA-145介導(dǎo)OCT4表達(dá)以促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞分化的機(jī)制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌(Endometrial Carcinoma)是女性生殖道常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一,嚴(yán)重影響了廣大女性的生殖健康和生活質(zhì)量,且近年來(lái)由于環(huán)境因素的變化和女性激素的濫用,其發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)。影響子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的因素諸多,其中以腫瘤細(xì)胞的分化程度尤為重要。細(xì)胞的分化越差,則患者的預(yù)后越差。腫瘤細(xì)胞與其來(lái)源的細(xì)胞相比,主要表現(xiàn)為低分化和高度增殖的特性,分化程度越低,細(xì)胞增殖越快,腫瘤的惡性程度越高；而分化程度高的腫瘤則接近正常組織

2、,生長(zhǎng)緩慢且預(yù)后好。既然分化障礙與惡性腫瘤的形成密切相關(guān),那么誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化,從而達(dá)到治療甚至治愈腫瘤的目的,就成為眾多學(xué)者的研究方向。但迄今為止,除高效孕激素可用于孕激素受體陽(yáng)性的高分化子宮內(nèi)膜癌外,其它有效的可用于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或低分化癌的誘導(dǎo)分化劑還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 大量的研究表明,腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(Cancer stem cell-like cells,CSCLCs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。干細(xì)胞研

3、究在過(guò)去十年的飛速發(fā)展促進(jìn)了腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)的發(fā)展。有學(xué)者認(rèn)為腫瘤組織主要由三種細(xì)胞組成:1、具有無(wú)限增殖能力和形成新的腫瘤克隆的腫瘤細(xì)胞,即所謂的“腫瘤干細(xì)胞”；2、具有有限增殖能力但不能形成新的腫瘤克隆的細(xì)胞；3、喪失了上述兩種能力的腫瘤細(xì)胞。其中腫瘤干細(xì)胞雖占少數(shù),但由于其具有自我更新、無(wú)限增殖和多向分化潛能等干細(xì)胞特性,成為腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的根源。維持干細(xì)胞多能性的關(guān)鍵因子OCT4在處于未分化狀態(tài)的CSCLCs中呈高表達(dá),在由

4、不同分化狀態(tài)細(xì)胞組成的腫瘤組織中表達(dá)明顯降低,而上調(diào)OCT4可使干細(xì)胞維持其自我更新和無(wú)限增殖的能力。這說(shuō)明OCT4與腫瘤細(xì)胞的分化狀態(tài)密切相關(guān)。抑制OCT4的表達(dá)有可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化。并且已有學(xué)者證實(shí),體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株具有腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的特性,而裸鼠移植瘤內(nèi)的細(xì)胞則由于體內(nèi)微環(huán)境的變化而呈現(xiàn)出不同的分化狀態(tài)。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一類小RNA分子,能以不完全互補(bǔ)的方式與其靶mRNA的3’非翻譯端的

5、特定區(qū)域相互作用,引起mRNA的切割降解,蛋白翻譯抑制,進(jìn)而影響靶基因的表達(dá)和作用。大量研究表明miRNA表達(dá)的變化與人類多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。但何種miRNA能作用于靶基因進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化,以達(dá)到治療腫瘤的目的尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。MicroRNA-145(miR-145)在生殖細(xì)胞系以及中胚層來(lái)源的組織中呈高表達(dá)。因此miR-145在中胚層來(lái)源的子宮內(nèi)膜組織的細(xì)胞分化中很有可能起到了關(guān)鍵作用。已有研究證明,在胚胎干細(xì)

6、胞中OCT4作為miR-145的靶基因,受其抑制,引起胚胎干細(xì)胞向類胚體的各胚層細(xì)胞分化。由此本研究設(shè)想是否miR-145在腫瘤細(xì)胞中也可通過(guò)調(diào)控信號(hào)分子OCT4的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化呢?
　　 基于以上發(fā)現(xiàn),本研究通過(guò)以下三部分進(jìn)行探索:
　　 1、利用體外培養(yǎng)的Ishikawa細(xì)胞以及裸鼠移植瘤模型檢測(cè)了不同分化狀態(tài)下miR-145和OCT4的表達(dá)及相互作用關(guān)系。
　　 2、利用功能獲得和功能缺失

7、實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)miR-145可通過(guò)抑制OCT4的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化。
　　 3、檢測(cè)高、低分化子宮內(nèi)膜癌組織中miR-145和OCT4的表達(dá)情況。為尋找一種嶄新的腫瘤治療途徑,從而提高子宮內(nèi)膜癌患者的生存率和治愈率提供新的思路。
　　 目的:檢測(cè)miR-145和OCT4在體外培養(yǎng)的Ishikawa細(xì)胞以及Ishikawa裸鼠移植瘤中的表達(dá)情況和作用關(guān)系。
　　 方法:利用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR

8、)和流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株和裸鼠移植瘤中miR-145和OCT4的表達(dá)變化,找出它們相互間的變化規(guī)律；并利用熒光素酶報(bào)道基因的方法,證明在Ishikawa細(xì)胞中miR-145是否直接作用于信號(hào)分子OCT4的3’非翻譯區(qū)(3’UTR),進(jìn)而影響OCT4的表達(dá)；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和流式細(xì)胞技術(shù),證實(shí)miR-145是否通過(guò)蛋白翻譯抑制來(lái)影響OCT4的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、體外培養(yǎng)的

9、Ishikawa細(xì)胞中OCT4在mRNA和蛋白水平均呈高表達(dá),流式細(xì)胞分析顯示與ISO type同型對(duì)照相比,OCT4陽(yáng)性細(xì)胞高達(dá)90％,而在Ishikawa裸鼠移植瘤中OCT4的表達(dá)雖可檢測(cè)到,但與培養(yǎng)細(xì)胞相比明顯降低,流式細(xì)胞分析中OCT4陽(yáng)性率僅為5％。與OCT4情況相反,miR-145在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于在移植瘤中的表達(dá)。
　　 2、與陰性對(duì)照及miR-Scramble(miR-SC)相比,miR-145成熟體(m

10、iR-145mimics)和OCT43’UTR共轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞能明顯降低報(bào)告質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),說(shuō)明外源性的miR-145可直接作用于OCT4；同時(shí)對(duì)比了單獨(dú)轉(zhuǎn)染OCT43’UTR和未轉(zhuǎn)染OCT43’UTR的報(bào)告質(zhì)粒熒光強(qiáng)度變化,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染OCT43'UTR的報(bào)告質(zhì)粒熒光強(qiáng)度明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明內(nèi)源性的miR-145也可直接作用于OCT4。
　　 3、在轉(zhuǎn)

11、染miR-145 mimics入Ishikawa細(xì)胞48小時(shí)后,分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平來(lái)檢測(cè)OCT4的表達(dá)量。結(jié)果顯示OCT4的mRNA并未發(fā)生明顯變化,而其蛋白水平卻明顯下降(P<0.05)。
　　 結(jié)論:本研究首次發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中miR-145與干細(xì)胞因子OCT4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),并與腫瘤細(xì)胞的分化程度有關(guān)。外源或內(nèi)源性的miR-145均可作用于mRNA的3’UTR區(qū)來(lái)直接調(diào)控OCT4的表達(dá)并對(duì)細(xì)

12、胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。miR-145是通過(guò)蛋白質(zhì)翻譯抑制來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)OCT4的表達(dá)。
　　 目的:通過(guò)功能獲得和功能缺失實(shí)驗(yàn),利用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株和動(dòng)物模型,展開(kāi)miR-145通過(guò)調(diào)控OCT4表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的作用機(jī)制研究。以證明miR-145在體外和體內(nèi)均可通過(guò)抑制OCT4的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化。為選擇新的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑提供了新的思路和方法。
　　 方法:
　　 1、利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、流式細(xì)胞

13、技術(shù)測(cè)定體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-145 mimics和miR-145抑制劑(miR-145 inhibitor)48小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)OCT4的表達(dá)變化；利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和real-time PCR技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染OCT4的小RNA干擾劑(siRNA OCT4)48小時(shí)后,細(xì)胞內(nèi)miR-145的變化。
　　 2、利用westernblot和real-time PCR技術(shù)觀察了細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145 mimics,

14、inhibitor以及siRNA OCT472小時(shí)后,子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞分化標(biāo)記物glycodelin的變化。
　　 3、利用以慢病毒為載體的miR-145(lenti-miR-145)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株觀察了miR-145在體內(nèi)對(duì)OCT4的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、轉(zhuǎn)染miR-145 mimics48小時(shí)后,與miR-SC相比,顯著地下調(diào)了細(xì)胞OCT4的表達(dá)(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor48

15、小時(shí)后,細(xì)胞OCT4水平比SC對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。與其SC對(duì)照和空白對(duì)照相比,siRNA OCT4轉(zhuǎn)入Ishikawa細(xì)胞48小時(shí)后,細(xì)胞內(nèi)miR-145的水平明顯上調(diào),而OCT4的水平明顯下降。(P<0.05)
　　 2、在分別轉(zhuǎn)染miR-145mimic、miR-145 inhibitor和siRNA OCT4以及它們的SC對(duì)照入Ishikawa細(xì)胞72小時(shí)后,與其SC以及空白對(duì)照相比,glycodelin的表達(dá)

16、水平在miR-145 mimics和siRNA OCT4組顯著上調(diào),而在miR-145 inhibitor組明顯下降(P<0.05)。
　　 3、體內(nèi)試驗(yàn)中(in vivo),與SC對(duì)照和空白對(duì)照組相比,lenti-miR-145組OCT4的表達(dá)明顯下調(diào),而glycodelin的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。Lenti-miR-145明顯抑制了腫瘤的生長(zhǎng),但并未阻止腫瘤的生長(zhǎng)。
　　 結(jié)論:
　　 1、在Ishi

17、kawa細(xì)胞中,miR-145的過(guò)表達(dá)可抑制OCT4的表達(dá)水平,而OCT4對(duì)miR-145也有負(fù)反饋?zhàn)饔谩?br>　　 2、miR-145通過(guò)抑制OCT4的表達(dá)促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞分化,而抑制OCT4表達(dá)使內(nèi)源性miR-145上調(diào)同樣可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化。
　　 3、在體內(nèi)miR-145同樣可抑.制OCT4的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化,并抑制了腫瘤組織的增長(zhǎng)。
　　 目的:證實(shí)腫瘤的分化程度與腫瘤組織內(nèi)miR

18、-145和OCT4的表達(dá)水平有相關(guān)性,進(jìn)一步驗(yàn)證miR-145的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化的作用。
　　 方法:利用real-timePCR、流式細(xì)胞技術(shù)以及HE染色和免疫組化方法,檢測(cè)高分化和低分化人體子宮內(nèi)膜癌組織中miR-145及OCT4的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、miR-145在正常內(nèi)膜組織和兩種癌組織中都能檢測(cè)到,但與高分化癌和正常內(nèi)膜相比,低分化癌組中的miR-145表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。

19、
　　 2、與miR-145相反,OCT4在正常內(nèi)膜組織中不表達(dá),高分化癌中呈低表達(dá),而在低分化癌中呈高表達(dá)(P<0.05)。
　　 結(jié)論:miR-145的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤分化級(jí)別呈正相關(guān)。OCT4與腫瘤的分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。OCT4和miR-145或可成為腫瘤分化程度的標(biāo)識(shí)物,用于子宮內(nèi)膜癌的診斷。
　　 總之,本課題通過(guò)體內(nèi)、體外以及子宮內(nèi)膜癌實(shí)體腫瘤驗(yàn)證三個(gè)部分,首次闡明在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及組織中miR-1

20、45與干細(xì)胞因子OCT4之間存在著雙向負(fù)反饋關(guān)系。并利用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行了miR-145與OCT4間體內(nèi)和體外相互干預(yù)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn),從基因和蛋白水平,探討了miR-145作為OCT4的抑制因子,通過(guò)下調(diào)其表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖并進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向接近正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化的可能性。最后又在子宮內(nèi)膜癌患者的實(shí)體腫瘤中對(duì)miR-145和OCT4的表達(dá)變化與高、低分化子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系。為尋找新的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的治療方法提