高糖所致大鼠血管平滑肌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及蛋白質(zhì)硝化研究.pdf

1、糖尿病對(duì)身體的危害主要來(lái)自高糖導(dǎo)致的多種并發(fā)癥，在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中，氧化應(yīng)激發(fā)揮著重要的作用。伴隨著高糖所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激的發(fā)生，過(guò)量產(chǎn)生的O2.-降低NO的生物活性，同時(shí)生成更強(qiáng)的氧化劑，如過(guò)氧亞硝基陰離子（ONOO-），進(jìn)而損傷蛋白質(zhì)生成3-硝基酪氨酸（3-NT）。目前已在許多糖尿病并發(fā)癥中發(fā)現(xiàn)3-NT的存在，但并沒(méi)有對(duì)其機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)的研究。本論文主要對(duì)高糖和外源性硝化試劑（hemin-nitrite-H2O2和SIN-1）作

2、用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304）以及大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）后所致細(xì)胞氧化損傷進(jìn)行了研究，觀察蛋白質(zhì)硝化反應(yīng)是否進(jìn)一步加重了細(xì)胞損傷的程度。同時(shí)我們還觀察了高糖和外源性硝化導(dǎo)致的細(xì)胞硝化蛋白之間的異同。所取得的主要結(jié)果如下： 1、高糖導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304）氧化損傷以及引起蛋白質(zhì)硝化內(nèi)皮功能喪失以及進(jìn)一步的損害在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。在高糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程中，蛋白質(zhì)酪氨酸硝化參與

3、其中。有關(guān)高糖導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304）發(fā)生蛋白質(zhì)硝化反應(yīng)的研究還很少。用終濃度分別為30 mM和40 mM的D-葡萄糖作用ECV304細(xì)胞72 小時(shí)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞存活率、測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化水平、熒光檢測(cè)胞內(nèi)谷胱甘肽、熒光觀察胞內(nèi)活性氧、毛細(xì)管電泳檢測(cè)胞內(nèi)和胞外活性氮含量、凝膠電泳以及蛋白印跡分析細(xì)胞蛋白質(zhì)硝化等觀察高糖所導(dǎo)致的氧化損傷情況。經(jīng)過(guò)高糖作用72 小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)高糖可以導(dǎo)致ECV304發(fā)生嚴(yán)重的氧化損傷，且有劑量依賴性。

4、高糖所導(dǎo)致的氧化損傷表現(xiàn)在細(xì)胞存活率降低、丙二醛（MDA）的含量增加、谷胱甘肽（GSH）的含量降低、細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的含量增加以及一氧化氮（NO）及其代謝產(chǎn)物的含量（包括增加細(xì)胞內(nèi)亞硝酸鈉和培養(yǎng)基中硝酸鈉含量）增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明高糖可以導(dǎo)致ECV304細(xì)胞產(chǎn)生硝化蛋白，主要發(fā)生在分子量為66 kDa、50 kDa、43 kDa、34 kDa、30 kDa和23 kDa的蛋白上。通過(guò)對(duì)高糖作用ECV304 進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)高糖

5、可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的氧化損傷，并且推斷蛋白質(zhì)硝化反應(yīng)參與了氧化損傷的過(guò)程。2、高糖導(dǎo)致大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）氧化損傷以及引起蛋白質(zhì)硝化高糖可以導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧，進(jìn)而在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可能會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)發(fā)生蛋白質(zhì)酪氨酸硝化。目前尚無(wú)高糖與平滑肌細(xì)胞蛋白質(zhì)硝化的相關(guān)性研究。用終濃度分別為30 mM和40 mM的D-葡萄糖作用大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）3d和7d，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞存活率、熒光檢測(cè)胞內(nèi)谷胱甘肽、熒光觀察

6、胞內(nèi)活性氧、毛細(xì)管電泳檢測(cè)胞內(nèi)活性氮含量、凝膠電泳以及蛋白印跡分析細(xì)胞蛋白質(zhì)硝化等觀察高糖所導(dǎo)致的氧化損傷情況。結(jié)果表明，高糖以終濃度為30 mM和40 mM分別作用VSMC細(xì)胞3d和7d 后，可以顯著增加細(xì)胞的增殖、誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷（包括降低GSH 含量以及增加細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的含量）、導(dǎo)致VSMC中活性氮生成量增加，并證實(shí)高糖可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的酪氨酸硝化，硝化主要發(fā)生在分子量為55 kDa、30 kDa、26 kDa和

7、20 kDa的蛋白上。在高糖導(dǎo)致的細(xì)胞氧化損傷過(guò)程中，氧化損傷的程度隨著高糖濃度和作用時(shí)間的增加而加重。 3、高糖和外源性硝化試劑（hemin-nitrite-H2O2和SIN-1）所致細(xì)胞蛋白質(zhì)硝化有一定差別糖尿病并發(fā)癥的病理過(guò)程是復(fù)雜的，而導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生硝化反應(yīng)的途徑又是多樣的。鐵卟啉或者某些含鐵卟啉過(guò)氧化酶催化NO2-—H2O2蛋白質(zhì)硝化反應(yīng)在病理?xiàng)l件下是比ONOO-更容易發(fā)生的。有關(guān)高糖所導(dǎo)致的細(xì)胞蛋白質(zhì)硝化和外源性硝化

8、試劑所導(dǎo)致的細(xì)胞蛋白質(zhì)硝化之間的差別研究的很少。分別用高糖和外源性硝化試劑（hemin-nitrite-H2O2和SIN-1）作用ECV304和VSMC細(xì)胞72 小時(shí)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞存活率、凝膠電泳以及蛋白印跡分析細(xì)胞蛋白質(zhì)硝化等觀察高糖和外源性硝化試劑所導(dǎo)致的細(xì)胞氧化損傷。 研究結(jié)果表明：（1）蛋白質(zhì)硝化可以加重細(xì)胞損傷的程度；（2）對(duì)某些蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，高糖所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝化現(xiàn)象同其它外源性硝化試劑（如hemin-nitrite-