腫瘤壞死因子α對人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞和大鼠血管平滑肌細胞syndecan-4蛋白表達的影響.pdf

1、研究背景 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是導致臨床心腦血管疾病的重要原因之一。日益增多的證據(jù)表明，動脈粥樣硬化是對血管損傷的過度炎癥反應。腫瘤壞死因子α是一種主要由活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生的糖蛋白，TNF-α是炎癥反應的關鍵調節(jié)因子之一，可從多種不同的炎癥細胞中釋放，在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的作用。Syndecan-4是硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)類的跨膜轉運蛋白多糖synde

2、cans家族的成員之一。Syndecan-4是存在于血管床的主要蛋白聚糖之一，Syndecan-4作為一種與生長因子結合的共受體(co-receptor)，調控著多種細胞生物學效應，在細胞伸展、細胞識別、細胞粘附、細胞遷移和細胞增殖控制中扮演著重要的角色，同時也介導炎癥反應。因此研究syndecan-4在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的一系列潛在功能角色，從而為動脈粥樣硬化的防治提供新的思路是相當必要的。 目的 以體外

3、培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞和SD大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞為對象，應用MTS/PES、Westem blotting蛋白免疫印跡等方法觀察腫瘤壞死因子α分別對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞和大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞增殖及syndecan-4蛋白表達的影響，進一步從細胞和分子水平上闡述sylldecan-4蛋白在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法 1．細胞增殖的檢測： 實驗一：應用96孔板體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞

4、的細胞株，用終濃度為1，10，20，100ng/ml的TNF-α分別作用24小時及36小時，每組濃度每個時間鋪兩列孔，共16副孔。同樣實驗條件重復6次，每組共96例實驗數(shù)據(jù)。每次設相同例數(shù)的無TNF-α刺激的孔做為對照組進行比較，共96例對照實驗數(shù)據(jù)，以明確應用TNF-α刺激后的細胞是否比無刺激的細胞有變化。采用MTS/PMS法確定人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞的增殖狀態(tài)。 實驗二：96孔板體外培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞，用終濃度為

5、1，10，20，100ng/ml的TNF-α作用24小時，每組濃度鋪兩列孔，共16副孔。同樣實驗條件重復6次，每組共96例實驗數(shù)據(jù)。每次設相同例數(shù)的無TNF-α刺激的孔做為對照組進行比較，共96例對照實驗數(shù)據(jù)，以明確應用TNF-α刺激后的細胞是否比無刺激的細胞有變化。采用MTS/PMS法確定大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞的增殖狀態(tài)。 2．Syndecan-4蛋白表達的檢測： 實驗一：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞，用終濃度為1，

6、10，20，100ng/ml的TNF-α分別作用24小時及36小時，裂解細胞提取蛋白，考馬斯亮藍G-250染色法測定總蛋白濃度，利用Western blotting蛋白免疫印跡法測定人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞syndecan-4蛋白的表達情況。每組濃度每個時間重復實驗4次，共4例實驗數(shù)據(jù)，并每次設無TNF-α刺激的做為對照組，以便用于計算灰度值。 實驗二：體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈平滑肌細胞，分別用終濃度為1，1 0，20，100ng/ml的

7、腫瘤壞死因子α(TNF-α)作用24小時。裂解細胞提取蛋白，考馬斯亮藍G-250染色法測定總蛋白濃度，利用Westem blotting蛋白免疫印跡法測定大鼠胸主動脈平滑肌細胞syndecan-4蛋白的表達情況。每組濃度重復實驗4次，共4例實驗數(shù)據(jù)。并每次設無TNF-α刺激的做為對照組，以便用于計算灰度值。 結果 1、TNF-α對人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞增殖的影響在TNF-α存在24小0時的條件下，各組細胞的增殖率分別為對照組

8、1.956±0.214，TNF-αl00ng/ml組2.154±0.250，TNF-α20ng/ml組2.26±0.151，TNF-α10ng/ml組2.118±0.205，TNF-α1ng/ml組2.106±0.136。統(tǒng)計分析顯示低至1ng/ml的TNF-α仍能明顯刺激人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞的增殖(F=29.522，P<0.001)，其中以TNF-α20ng/ml組細胞增殖最顯著(F=29.522，P<0.001)。36小時各組細胞的增

9、殖率分別為對照組1.915±0.242，TNF-α100ng/ml組2.067±0.328，TNF-α20ng/ml組2.207±0.150，TNF-α10ng/ml組2.052±0.126，TNF-α1ng/ml組2.051±0.178。統(tǒng)計分析顯示低至1ng/ml的TNF-α仍能明顯刺激人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞的增殖(F=21.719，P<0.001)，其中仍以TNF-α20ng/ml組細胞增殖最顯著(F=21.719，P<0.001)。

10、但與24小時相比，細胞的增殖率有所減低。 2、TNF-α對人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞syndecan-4蛋白表達的影響以對照組的密度掃描結果為1，TNF-α作用人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞24小時的syndecan-4蛋白表達結果如下，1ng/ml組2.429±0.765，lOng/ml組3.284±0.582，20ng/ml組6.780±0.658，100ng/ml組4.026±0.445，與對照組相比均有顯著性差異。其中以20ng/ml TN

11、F-α組刺激人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞syndecan-4蛋白表達量最高，與其它劑量組相比均有顯著差異(F=36.846，P<0.001)，100ng/mlTNF-α組刺激人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞syndecan-4蛋白表達量較1ng/ml組為高(F=36.846，P=0.004)。當1、10、20、100 ng/ml的TNF-α作用36 h后，仍能明顯刺激人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞syndecan-4蛋白的表達(1ng/ml組1.322±0.114，10n

12、g/ml 2.239±0.079，20ng/ml組2.573±0.066，100ng/ml組2.155±0.108)，其中以TNF-α20ng/ml組細胞增殖最顯著(F=129.214，P<0.001)。但與24 h同等劑量組相比，人臍靜脈內(nèi)皮樣細胞syndecan-4蛋白的表達量明顯減少。3、TNF-α對SD大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響在TNF-α存在24小時的條件下，各組細胞的增殖率分別為對照組1.001±0.064，TNF-α 1

13、00ng/ml組1.215±0.231，20ng/ml組1.566±0.060，10ng/ml組1.125±0.198，1ng/ml組1.082±0.272。統(tǒng)計分析提示低至1ng/ml的TNF-α仍能明顯刺激大鼠血管平滑肌細胞的增殖(F=132.899，P=0.044)，其中以TNF-α20ng/ml組細胞增殖最顯著(F=132.899，P<0.001)。 4、TNF-α對SD大鼠血管平滑肌細胞syndecan-4蛋白表達的影

14、響以對照組的密度掃描結果為1，統(tǒng)計分析表明，1、10、20、100ng/ml的TNF-α均能明顯刺激大鼠血管平滑肌細胞syndecan-4蛋白的表達(1.24±0.126，1.639±0.345，4.937±0.598，3.708±0.37)，與對照組相比均有顯著性差異，其中以20ng/ml TNF-α組刺激血管平滑肌細胞syndecan-4蛋白表達量最高，與其它劑量組相比均有顯著差異(F=77.502，P<0.00 1)，1 00ng