IL-18基因單核苷酸多態(tài)性生物信息學(xué)研究與臨床評(píng)價(jià).pdf

1、研究背景 近年來人類基因組計(jì)劃和其它物種基因組計(jì)劃的啟動(dòng)和實(shí)施，使人類在生命科學(xué)領(lǐng)域尤其是核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的序列、結(jié)構(gòu)與功能等領(lǐng)域迅速積累了大量數(shù)據(jù)。人們渴求新知的愿望促使人們?nèi)ネ诰蜻@些巨量數(shù)據(jù)。由生命科學(xué)和信息技術(shù)等學(xué)科相結(jié)合而形成的新興交叉學(xué)科一生物信息學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。在應(yīng)用研究方面，生物信息學(xué)在尋找人類疾病基因、預(yù)測(cè)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的結(jié)構(gòu)及功能和合理設(shè)計(jì)藥物等方面都起著至關(guān)重要的作用。 隨著分子遺傳學(xué)的進(jìn)展，疾

2、病遺傳學(xué)研究從簡(jiǎn)單的單基因疾病轉(zhuǎn)向于復(fù)雜的多基因疾病(如免疫相關(guān)疾病、心血管疾病、各種腫瘤等)的研究中。目前認(rèn)為基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)及其特定的組合可能是造成宮頸癌等一些復(fù)雜性狀疾病易感性的最重要的原因。但尋找與疾病表型相關(guān)的遺傳位點(diǎn)并非是一項(xiàng)容易的工作。據(jù)估計(jì)，人類30億堿基中大約有數(shù)百萬個(gè)SNPs位點(diǎn)。因此，在疾病分子流行病學(xué)研究中如何進(jìn)行基因多念性研究?在如此眾多的基因及SNP位點(diǎn)中選擇哪些基因以及哪些SNPs位點(diǎn)進(jìn)行研究?

3、這些已成為許多醫(yī)學(xué)研究工作者共同關(guān)注的問題。本研究以分析細(xì)胞因子IL-18基因重要單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為例，探討生物信息學(xué)篩選疾病基因SNP 位點(diǎn)的方法，并臨床評(píng)價(jià)方法的有效性。研究目的和意義： 1、采用生物信息學(xué)策略篩選細(xì)胞因子IL-18基因重要單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，建立一種篩選疾病相關(guān)SNP 位點(diǎn)的方法； 2、以宮頸癌疾病為例，檢測(cè)選定的IL-18基因SNP 位點(diǎn)基因型，臨床評(píng)價(jià)此SNP是否與宮頸癌相關(guān)，從基因水平驗(yàn)證生

4、物信息學(xué)篩選策略的有效性； 3、以宮頸癌疾病為例，檢測(cè)IL-18血清水平，臨床評(píng)價(jià)候選SNP 位點(diǎn)與IL-18血清水平的關(guān)系以及對(duì)于疾病的意義，從蛋白水平驗(yàn)證生物信息學(xué)篩選策略的有效性。 方法： 1、生物信息學(xué)策略篩選宮頸癌相關(guān)IL-18基因SNP位點(diǎn)IL-18是一種1996年命名的多功能細(xì)胞因子。我們重點(diǎn)研究存在于調(diào)控區(qū)以及編碼區(qū)的SNPs，因?yàn)樗鼈冎苯佑绊懟虻墓δ芎捅磉_(dá)水平。由于IL-8調(diào)控區(qū)范圍較大，我們

5、重點(diǎn)研究文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)IL-18轉(zhuǎn)錄表達(dá)明確調(diào)控作用的一段啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域。使用SNPper軟件從公共數(shù)據(jù)庫dbSNP獲得IL-18調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)的SNPs數(shù)據(jù)。對(duì)于編碼區(qū)SNPs，先使用同源模型數(shù)據(jù)庫搜索得到IL-18同源序列模塊Blocks，Blocks是在進(jìn)化過程中非常保守的區(qū)域。然后使用PARSESNP軟件進(jìn)行篩選和分析編碼區(qū)SNPs是否對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生影響；對(duì)于調(diào)控區(qū)SNPs，使用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位預(yù)測(cè)軟件分析調(diào)控區(qū)SNPs是否對(duì)

6、基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平產(chǎn)生影響。從而確定IL-18基因重要SNP，作為與細(xì)胞因子IL-18關(guān)系密切的疾病研究的候選多態(tài)性位點(diǎn)。 2、候選IL-18基因SNP 位點(diǎn)與宮頸癌相關(guān)性研究通過文獻(xiàn)檢索確定IL-18基因?yàn)閷m頸癌相關(guān)候選研究基因。納入宮頸癌確診患者與正常人作為研究對(duì)象，采用病例對(duì)照研究方法。采集外周靜脈血，用直接測(cè)序法對(duì)候選SNP 位點(diǎn)的基因型進(jìn)行檢測(cè)，獲得候選SNP 位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，然后病例組與對(duì)照組之間進(jìn)行統(tǒng)

7、計(jì)分析兩者相關(guān)性。 3、候選IL-18基因SNP 位點(diǎn)與宮頸癌患者IL-18血清水平相關(guān)性研究納入宮頸癌確診患者與正常人作為研究對(duì)象。采集外周靜脈血，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清IL-18含量。然后通過析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，檢驗(yàn)宮頸癌患病與否以及不同IL-18基因型對(duì)IL-18血清濃度變異的主效應(yīng)與交互效應(yīng)。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 10.0專業(yè)版統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。宮頸癌患者組和正常對(duì)照

8、組等位基因及基因型分布頻率比較采用x<'2>檢驗(yàn)。宮頸癌患者組和正常對(duì)照組，以及不同基因型組下的血清IL-18平均濃度之間的比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。 結(jié)果： 1、經(jīng)過SNPper軟件分析，共獲得候選啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)SNP(rs5744224、rs1946519、rs1946518、rs5744225、rs5744226)，編碼區(qū)2個(gè)SNP(coding SNP，cSNP)(rs549908、rs

9、5744290)。通過分析我們發(fā)現(xiàn)IL-18編碼區(qū)的2個(gè)SNP位點(diǎn)由于屬于同義SNP，不會(huì)影響蛋白功能，所以將2個(gè)編碼區(qū)SNP均排除研究之外。將候選的IL-18基因調(diào)控區(qū)DNA序列在兩個(gè)在線預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行潛在的真核轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)的搜索分析。其中TFSEARCH搜索分析表明，Score值等于或大于90.0的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)共12個(gè)，只有rs1946518這個(gè)SNP位點(diǎn)存在于轉(zhuǎn)錄因子CdXA(caudal type homeobox tra

10、nscription factor A，尾型同源異型轉(zhuǎn)錄因子A)結(jié)合部位；Alibaba2.1軟件搜索分析表明，將矩陣保守性參數(shù)設(shè)置在80％以上，則候選DNA序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)共13個(gè)，只有rs19446518這個(gè)SNP位點(diǎn)存在于轉(zhuǎn)錄因子HNF-1C(hepatic nuclear factor 1-C，肝核轉(zhuǎn)錄因子1-C)結(jié)合部位。其他4個(gè)SNP位點(diǎn)均未有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。另根據(jù)文獻(xiàn)檢索，rs1946518這個(gè)SNP位點(diǎn)還是轉(zhuǎn)錄因子3

11、'，5'-環(huán)單磷酸腺苷(3'，5'-cyclic adenosine monophoshate，cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白結(jié)合區(qū)。所以rs1946518很有可能對(duì)IL-18的轉(zhuǎn)錄翻譯水平有重大影響。因此我們選定rs1946518這個(gè)SNP位點(diǎn)為IL-18基因的重要候選位點(diǎn)。預(yù)測(cè)此位點(diǎn)可能影響IL-18的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，從而影響機(jī)體對(duì)疾病的抵抗作用。2、基因直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)調(diào)控區(qū)5個(gè)SNP 中有rs1946519(T/G)、rs1946518(

12、A/C)2個(gè)SNP位點(diǎn)呈多態(tài)性并有連鎖關(guān)系。rs1946518以三種基因型存在：TT、GG、TG?；颊呓M3種基因型頻率分別為56％(28/50)、10％(5/50)、34％(17/50)，對(duì)照組3種基因型頻率分別18％(9/50)、34％(17/50)、48％(17/50)。宮頸癌患者與對(duì)照組之間等位基因T、G頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x<'2>=19.662，P=0.000)；兩組研究對(duì)象基因型的分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x<'2>=17

13、.497，P=0.000)。 3、測(cè)定了所有研究對(duì)象血清IL-18含量，結(jié)果顯示宮頸癌患者與正常對(duì)照組之間血清IL-18平均濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.445，P=0.000)；按照rs1946518位點(diǎn)rrT、GG、TG三個(gè)基因型分為三組，3組的血清IL-18平均濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.307，P=0.000)；宮頸癌患病與否與不同IL-18基因型之間交互效應(yīng)顯著(F=4.223，P=0.018)。 對(duì)

14、照組中不同IL-18基因型的血清IL-18濃度比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.147，P=0.326)。病例組中不同IL-18基因型的血清IL-18濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.445，P=0.000)。進(jìn)一步用多重比較，TT基因型組的IL-18平均濃度最低，與其它兩組的平均濃度之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。TG組平均濃度雖然比GG組高，但兩者之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.379)。 結(jié)論： 1、用生

15、物信息學(xué)策略初篩疾病相關(guān)SNP位點(diǎn)，雖然可能忽略某些位點(diǎn)，但不失為一種事半功倍的方法，可以大大減少大規(guī)模篩查實(shí)驗(yàn)的操作，從而為進(jìn)一步探討疾病與某一基因的關(guān)聯(lián)性提供很有價(jià)值的信息。 2、IL一18基因啟動(dòng)子區(qū)rs1946518位點(diǎn)多態(tài)性與宮頸癌相關(guān)，宮頸癌組T等位基因頻率較高，正常對(duì)照組G等位基因頻率較高。 3、IL-18血清濃度變化不但與IL-18基因型有關(guān)，而且與宮頸癌發(fā)病過程中的其他因素有關(guān)。 4、IL-18

16、基因rs1946518位點(diǎn)多態(tài)性可以影響血清IL-18水平。這可能導(dǎo)致宮頸癌患者的免疫平衡失調(diào)，Th1型反應(yīng)模式占弱勢(shì)狀態(tài)，細(xì)胞免疫功能不能有效地激活，機(jī)體免疫功能處于抑制狀態(tài)，從而有利于腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。這將會(huì)為宮頸癌的早期診斷、一級(jí)預(yù)防等提供線索，并可制定更可靠的治療手段。 研究創(chuàng)新之處： 1、探索建立了一種篩選疾病相關(guān)基因的SNP 位點(diǎn)的生物信息學(xué)策略并作了臨床評(píng)價(jià)，為今后開展類似研究做了方法學(xué)基礎(chǔ)； 2、