介入栓塞聯(lián)合三氧化二砷對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及其機(jī)制的實(shí)驗研究.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分
　　缺氧對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響的實(shí)驗研究
　　目的:
　　目前肝動脈化療栓塞(TACE)已經(jīng)成為不能手術(shù)切除肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療，但是TACE后殘存癌細(xì)胞處于缺氧環(huán)境中，其分子生物學(xué)特性會發(fā)生改變。本研究利用大鼠肝癌細(xì)胞株McA-RH7777，通過氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)缺氧，研究體外缺氧對肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力影響，并探索其相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:

2、r>　　利用本實(shí)驗室前期建立的穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的McA-RH7777細(xì)胞株，分別以不同濃度的CoCl2誘導(dǎo)缺氧后進(jìn)行培養(yǎng)，通過CCK-8法確定有效的藥物濃度。采用Transwell實(shí)驗研究缺氧對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響，并通過劃痕實(shí)驗研究缺氧條件下細(xì)胞遷移能力的變化。通過Western blot分析細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的

3、變化，實(shí)時定量PCR進(jìn)一步檢測EMT調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Twist和SnailmRNA水平差異。
　　結(jié)果:
　　100μmol/L CoCl2處理24h能誘導(dǎo)缺氧條件，HIF-1α表達(dá)水平升高，但是McA-RH7777細(xì)胞增殖和凋亡無顯著影響。Transwell實(shí)驗結(jié)果顯示缺氧組通過Matrigal膜的細(xì)胞數(shù)為30.2±2.46，較對照組(20.4±1.89)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.013)。劃痕實(shí)驗顯示缺氧條件下細(xì)胞

4、劃痕修復(fù)能力較對照組明顯增加。缺氧細(xì)胞上皮分子E-cadherin表達(dá)減少，而N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)分子表達(dá)增多，提示缺氧條件下肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。缺氧后肝癌細(xì)胞TwistmRNA水平增加，與對照組比較，mRNA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而Snail mRNA水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　體外缺氧能引起Twist轉(zhuǎn)錄因子水平增加，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動及侵襲能力的

5、增加。
　　第二部分
　　三氧化二砷抑制缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其機(jī)制的實(shí)驗研究
　　目的:
　　三氧化二砷(ATO)對包括急性早幼粒細(xì)胞白血病在內(nèi)的多種腫瘤均具有一定的殺傷作用，最近發(fā)現(xiàn)在肝癌的治療中亦有一定療效。本部分實(shí)驗研究體外缺氧和常規(guī)培養(yǎng)條件下ATO對大鼠肝癌McA-RH7777細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響以及機(jī)制。
　　方法:
　　利用本實(shí)驗室建立的穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的肝癌細(xì)胞株，研

6、究ATO對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。以氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)體外缺氧條件，通過劃痕實(shí)驗和Transwell實(shí)驗分別研究ATO在體外缺氧條件下對腫瘤細(xì)胞的侵襲能力的影響。免疫熒光及Western blot進(jìn)一步分析ATO處理后細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表達(dá)水平的變化，研究ATO對缺氧誘導(dǎo)的EMT及其調(diào)節(jié)因子Twist的影響。
　　結(jié)果:
　　ATO對McA-

7、RH7777大鼠肝癌細(xì)胞增殖有抑制作用，能引起不同程度的細(xì)胞凋亡，呈明顯的時間和劑量依賴關(guān)系。低濃度ATO(2μmol/L)作用24h對細(xì)胞增殖和凋亡影響作用不顯著，但是能明顯抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。對于缺氧引起的肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力增加，ATO有明顯的抑制作用。免疫熒光及Western blot結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，缺氧細(xì)胞的胞膜E-cadherin表達(dá)減少，N-cadherin表達(dá)增加。ATO處理后能上調(diào)缺氧細(xì)胞E-cad

8、herin的表達(dá)，抑制缺氧細(xì)胞發(fā)生EMT。同樣對于缺氧后細(xì)胞胞膜及核內(nèi)Twist表達(dá)的增加，ATO有明顯的抑制作用。
　　結(jié)論:
　　ATO能誘導(dǎo)McA-RH7777大鼠肝癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的增殖，呈明顯的時間和劑量依賴效應(yīng)。低濃度ATO能下調(diào)Twist表達(dá)抑制缺氧誘導(dǎo)的EMT，從而抑制缺氧條件下肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的增加。
　　第三部分
　　介入栓塞聯(lián)合三氧化二砷對大鼠肝癌轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制的實(shí)驗研究

9、　　目的:
　　本實(shí)驗通過肝癌動物模型研究經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞(TAE)對肝細(xì)胞肝癌(HCC)轉(zhuǎn)移潛能潛能的影響，并進(jìn)一步研究TAE術(shù)后聯(lián)合應(yīng)用ATO對HCC侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。
　　方法:
　　將McA-RH7777大鼠肝癌細(xì)胞種植于Buffalo大鼠皮下成瘤，然后應(yīng)用皮下瘤組織塊建立大鼠原位肝腫瘤模型40只。將大鼠隨機(jī)分為4組:TAE+ATO組、TAE組、ATO組和對照組。TAE術(shù)在建模后14天進(jìn)行，采用逆行胃十二指腸插管

10、，注入超液化碘油（0.2 ml/kg）與生理鹽水的混懸液（碘油∶生理鹽水=1∶2）。ATO在TAE術(shù)后3天開始按2 mg/kg腹腔內(nèi)注射，每天一次，每次按2 mg/kg體重給藥，連續(xù)應(yīng)用5天后改為每周3次，術(shù)后2周停止給藥。以生理鹽水作為栓塞劑和藥物的陰性對照。干預(yù)治療前后定期行MRI檢查，評價肝內(nèi)腫瘤的生長情況。TAE術(shù)后14天取各組5只大鼠行病理組織學(xué)檢查。通過熒光顯像觀察肺部轉(zhuǎn)移情況，殘癌細(xì)胞分子水平的變化則通過Western b

11、lot和免疫組化評估。各組剩余大鼠隨訪肝功能變化并進(jìn)行生存分析。
　　結(jié)果:
　　肝臟腫瘤移植術(shù)后14天，MRI檢查顯示40只大鼠肝內(nèi)均可見腫瘤生長，成瘤率100％。肝臟腫瘤在T1WI上呈低信號，在T2WI上呈高信號。T2WI顯示肝臟腫瘤平均直徑8.16±0.09 mm，腫瘤平均體積201.80±7.68 mm3。TAE能明顯抑制肝臟腫瘤的生長，但是肺轉(zhuǎn)移明顯高于對照組，殘癌組織發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，E-cadheri

12、n表達(dá)降低，N-cadherin、Vimentin表達(dá)增加。聯(lián)合使用ATO腹腔注射能明顯抑制TAE后EMT的發(fā)生，減少肺轉(zhuǎn)移。Western blot和免疫組化結(jié)果顯示ATO能抑制EMT調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Twist的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　TAE術(shù)后缺氧引起殘癌細(xì)胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致HCC的轉(zhuǎn)移潛能增加，而ATO能抑制TAE后殘癌侵襲和轉(zhuǎn)移的增加，其機(jī)制可能是通過抑制轉(zhuǎn)錄因子Twist的激活從而抑制EMT的發(fā)生。TAE后聯(lián)合ATO具