PCR技術(shù)檢測肝硬化患者腹水中細(xì)菌編碼165S rRNA基因的研究.pdf

1、肝硬化合并腹水患者特別是伴有嚴(yán)重肝功能障礙者，易發(fā)生細(xì)菌易位，后者可導(dǎo)致腹水感染的發(fā)生。此外，細(xì)菌易位還通過一系列機制激活患者免疫系統(tǒng)，致機體處于高動力循環(huán)狀態(tài)，從而引起門脈高壓、肝腎綜合征形成，因此，對于細(xì)菌易位的研究具有重要意義。
　　目的：
　　探討應(yīng)用聚合酶鏈(PCR)技術(shù)擴增肝硬化患者腹水中細(xì)菌16S核糖體RNA(16S rRNA)基因片段從而檢測機體細(xì)菌易位(BT)的可行性，并結(jié)合臨床資料探討肝硬化合并腹水患者發(fā)

2、生細(xì)菌易位的高危因素及其了解其抗菌藥物應(yīng)用情況。
　　方法：
　　1.標(biāo)本的收集：收集2011年8月-2012年2月天津市傳染病醫(yī)院肝病內(nèi)科住院的肝硬化合并腹水患者腹水標(biāo)本48例。
　　2.腹水標(biāo)本中細(xì)菌16S rRNA基因的擴增及鑒別：在細(xì)菌16S rRNA基因保守區(qū)設(shè)計1對細(xì)菌通用引物，對48例肝硬化合并腹水患者的腹水標(biāo)本進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，同時做陽性、陰性及空白對照，并檢測實驗特異

3、性及敏感性，對于腹水細(xì)菌DNA陽性者進(jìn)一步通過核苷酸序列測定鑒別細(xì)菌的種屬。
　　3.臨床資料的收集及分析：對腹水細(xì)菌DNA陽性與陰性組的血清及腹水常規(guī)、生化、并發(fā)癥、既往史等指標(biāo)進(jìn)行t檢驗及χ2檢驗，從而了解肝硬化合并腹水患者發(fā)生細(xì)菌易位的高危因素，并分析本次入組患者抗生素應(yīng)用情況。
　　結(jié)果：
　　1.通過在16S rRNA基因保守區(qū)設(shè)計引物，對48例肝硬化腹水標(biāo)本進(jìn)行擴增，共有15例獲得370bp DNA片段，陽

4、性率為31.25％(15/48)。通過對細(xì)菌DNA陽性標(biāo)本 PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因序列測序及BLAST對比，共檢測出15株細(xì)菌，分別為大腸桿菌10株，陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、魯氏不動桿菌、巴斯德菌和金黃色葡萄球菌各1株。
　　2.通過分析腹水中細(xì)菌DNA陽性與陰性組血清及腹水常規(guī)、生化、并發(fā)癥、既往史等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)兩組患者在血白細(xì)胞數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞數(shù)(NEUT)、血鈉(Na)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、腹水多形核粒細(xì)胞比例(PMN

5、％)、上消化道出血發(fā)病率、既往SBP史和肝功能Child-Pugh積分方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.將腹水多形核粒細(xì)胞數(shù)(PMN)≥250/mm3作為診斷腹水感染金標(biāo)準(zhǔn)，則腹水細(xì)菌DNA陽性診斷腹水感染的特異性為72.50％、敏感性為50.00％，腹水細(xì)菌培養(yǎng)陽性診斷腹水感染的特異性為87.50％、敏感性為12.50％。
　　4.對照實驗中陽性對照菌均擴增出陽性DNA片段，而陰性及空白對照均未出現(xiàn)特異性條帶

6、；敏感性測定中DNA模板倍比稀釋后進(jìn)行PCR擴增，最低能夠檢測出10pg DNA。
　　5.48例入組患者中共27例靜脈應(yīng)用抗生素治療，絕大多數(shù)為單一用藥(91.90％)，排在前三位的是哌拉西林或頭孢哌酮聯(lián)合酶抑制劑、第三代頭孢菌素及碳青霉烯類(亞胺培南西司他丁)。對符合腹水多形核粒細(xì)胞數(shù)(PMN)≥250/mm3標(biāo)準(zhǔn)的SBP抗生素治療有效率為87.50％。
　　結(jié)論：
　　1.應(yīng)用 PCR技術(shù)擴增肝硬化患者腹水中細(xì)菌

7、16S rRNA基因具有可行性，可用于肝硬化患者腹水中細(xì)菌DNA的研究，檢出易位細(xì)菌以大腸桿菌為主。本研究方法與細(xì)菌培養(yǎng)相比更快捷，對于快速診斷腹水細(xì)菌感染及感染病原菌種類可能具有一定意義。
　　2.腹水細(xì)菌DNA陽性組與陰性組相比較，血白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、C反應(yīng)蛋白等炎癥因子、肝功能Child-Pugh積分、上消化道出血發(fā)生率、既往SBP史及血鈉水平存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.本次研究抗生素應(yīng)用以哌拉西林或頭孢哌酮聯(lián)合酶