甲真菌病診斷方法的改良及致病菌毒力相關(guān)因子的初步研究.pdf

1、甲真菌病是皮膚科的常見病和多發(fā)病，真菌學(xué)檢查是確診的主要依據(jù)，但現(xiàn)有方法尚難以滿足臨床的需要；此外，對該病致病菌毒力因子的研究仍處于起步階段，且多數(shù)未與臨床表現(xiàn)相結(jié)合。本課題就甲真菌病診斷方法的改良及其致病菌的毒力相關(guān)因子展開研究，包括以下四部分內(nèi)容：第一部分甲真菌病臨床診斷指征的初步探討目的對甲真菌病的臨床特征進行深入研究，以期發(fā)現(xiàn)該病及其致病菌臨床診斷的指征，作為實驗室檢查和流行病學(xué)調(diào)查的輔助方法。方法收集甲真菌病及非甲真菌病病例，

2、詳細記錄患者的一般情況、病史及病甲特征，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果1.共收集124例甲真菌病和29例其它甲病病例，培養(yǎng)陽性者中75例為紅色毛癬菌，6例念珠菌，1例尖孢鐮刀菌，1例厚皮馬拉色菌，1例白念珠菌+紅色毛癬菌。2.有6項病史(手足多汗史，淺部真菌病病史，密切接觸者中有淺部真菌病患者，掌跖脫屑史，趾指間浸漬糜爛史，掌跖/趾指腹水皰史)和2項體征(掌跖脫屑，單側(cè)指甲受累)高度提示甲真菌病；3.與紅色毛癬菌相比，指甲尤其是右側(cè)指甲受累

3、及甲分離高度提示念珠菌感染。結(jié)論甲真菌病有某些特征可作為診斷線索，臨床指征的最終確立尚有待多中心、大樣本、涵蓋不同人群、包括不同致病菌的流行病學(xué)調(diào)查。 第二部分甲真菌病診斷培養(yǎng)基的改良研究第一章改良皮膚癬菌試驗培養(yǎng)基的實驗研究目的對DTM培養(yǎng)基作適當改進，篩選出最佳配方，有利于甲真菌病等淺部真菌病的快速診斷和治療方案的制定。方法1.采用正交設(shè)計法和單因素分組試驗對培養(yǎng)基的主要影響因子進行量和質(zhì)的優(yōu)化組合，篩選出改良培養(yǎng)基。2.將

4、紅色毛癬菌標準菌株菌懸液倍比稀釋，接種于DTM和改良培養(yǎng)基上，測定檢出靈敏度。3.將3屬18種皮膚癬菌和11屬14種非皮膚癬菌的絲狀真菌接種于DTM和改良培養(yǎng)基上，比較特異性。結(jié)果1.培養(yǎng)基的氮源，碳源，pH值和指示劑的調(diào)整對變色時間的影響無顯著性差異(P＞0.05)，從經(jīng)濟和早期判斷顏色是否改變的難易程度考慮，確定改良培養(yǎng)基主要配方：0.5％大豆蛋白胨，0.5％葡萄糖，指示劑為溴百里酚藍(bromothymolblue，BTB)；2.

5、DTM和改良培養(yǎng)基的檢出靈敏度均為103cfu/mL(2×10cfu/培養(yǎng)基)；3.所有受試的皮膚癬菌均能使兩種培養(yǎng)基變色，相對變色時間tr(開始變色時間—開始生長時間)DTM為-2d～0d，改良培養(yǎng)基為-4d～0d；絕大多數(shù)受試的非皮膚癬菌的絲狀菌也能使兩種培養(yǎng)基變色，trDTM為1d～5d，改良培養(yǎng)基為1d～6d。結(jié)論改良培養(yǎng)基的配方比DTM經(jīng)濟，較DTM更易觀察到早期顏色的改變。 第二章改良皮膚癬菌試驗培養(yǎng)基(DTM)的臨

6、床研究目的將改良DTM培養(yǎng)基應(yīng)用于甲真菌病臨床標本的檢測，并與原DTM培養(yǎng)基比較，以評價其臨床實用性。方法收集臨床擬診或欲排除甲病的標本，分別接種于改良DTM、DTM、SCCA和SCA培養(yǎng)基；記錄菌株的開始生長時間、開始變色時間及開始變色時菌落的直徑。以專業(yè)真菌實驗室的鑒定結(jié)果為金標準，將DTM和改良DTM報告的結(jié)果與之比較。結(jié)果1.改良DTM、DTM、SCCA的分離率、菌株的生長速度及形態(tài)無顯著差異；2.所有分離的皮膚癬菌均能使兩種顯

7、色培養(yǎng)基變色，改良DTM的開始變色時間(5.83±0.39d)早于DTM(7.32±0.41d)；3.大多數(shù)分離的非皮膚癬菌也能使兩種培養(yǎng)基變色，以開始變色時菌落的直徑大小為皮膚癬菌和非皮膚癬菌的鑒別點與金標準有高度的一致性。結(jié)論DTM和改良DTM比傳統(tǒng)的鑒定方法結(jié)果報告時間提前1周左右，改良培養(yǎng)基的配方較DTM經(jīng)濟，肉眼觀察其開始變色時間早于DTM，值得進一步地深入研究。 第三部分PCR快速診斷甲真菌病的研究第一章PCR快速診

8、斷淺部真菌病目的初步評價應(yīng)用PCR技術(shù)直接從臨床標本中檢測淺部真菌病病原真菌的方法。方法采用蛋白酶K消化法和煮沸法處理臨床標本，從中提取致病菌DNA，然后用真菌通用引物ITS1進行PCR擴增檢測，并與直接鏡檢和培養(yǎng)法作對比。結(jié)果共收集112例臨床標本，PCR檢測、直接鏡檢和培養(yǎng)的敏感度分別為80.7％、96.5％和70.2％，特異度分別為100％、89.1％和100％，陽性預(yù)測值分別為100％、90.2％和100％，陰性預(yù)測值分別為83

9、.3％、96.1％和76.4％。PCR方法在24h內(nèi)即可完成從標本處理至結(jié)果判讀的全過程。結(jié)論PCR檢測具有較好的特異性和準確性，且比培養(yǎng)法縮短了近2w的時間，為臨床快速診斷和及時、合理地治療淺部真菌病提供參考。 第二章多重PCR診斷甲真菌病的實驗研究目的初步建立多重PCR診斷甲真菌病的方法。方法選擇3對引物(真菌通用引物，皮膚癬菌特異性引物和酵母特異性引物)建立3重PCR體系，采用紅色毛癬菌、白念珠菌和短帚霉摸索反應(yīng)條件和驗證

10、體系的適用性；并用紅色毛癬菌來測定反應(yīng)的靈敏度。結(jié)果1.篩選得到的真菌通用引物NS、皮膚癬菌特異性引物CHS1和酵母特異性引物ACT1有較好的通用性和特異性；2.在適宜的反應(yīng)條件下，無論對單模板，還是多模板，該反應(yīng)體系均能擴增出目的片段，未見明顯非特異片段的干擾；3.該反應(yīng)體系的檢測靈敏度為102cfu/mL。結(jié)論多重PCR技術(shù)可在較短時間內(nèi)檢測出皮膚癬菌，酵母和非皮膚癬菌的絲狀菌等三類病原菌，結(jié)果直觀易讀，其實用性尚有待于在臨床標本的

11、檢測中驗證。 第三章多重PCR快速診斷甲真菌病的臨床研究目的初步評價應(yīng)用多重PCR技術(shù)直接從臨床標本中檢測甲真菌病病原真菌的方法。方法采用蛋白酶K消化法和煮沸法處理臨床標本，從中提取致病菌DNA，然后用真菌通用引物NS，皮膚癬菌特異性引物CHS1和酵母特異性引物ACT1同時進行PCR擴增檢測，并與直接鏡檢和培養(yǎng)法作對比。結(jié)果共收集104例臨床標本，PCR檢測、直接鏡檢和培養(yǎng)的敏感度分別為93.3％、100％和64.4％，特異度分

12、別為100％、86.4％和100％，陽性預(yù)測值分別為100％、84.9％和100％，陰性預(yù)測值分別為95.2％、100％和78.74％。PCR方法在24h內(nèi)即可完成從標本處理至結(jié)果判讀的全過程。結(jié)論多重PCR檢測具有較好的特異性和準確性，可初步將甲真菌病的三大類病原菌區(qū)分開，且比培養(yǎng)縮短了近2w的時間，可為臨床快速診斷和及時、合理地治療甲真菌病提供參考。 第四章多重RT-PCR診斷甲真菌病的實驗研究目的初步建立多重RT-PCR診

13、斷甲真菌病的方法。方法采用Trizol提取真菌的RNA；選擇3對引物(真菌通用引物，皮膚癬菌特異性引物和酵母特異性引物)建立3重RT-PCR體系，采用紅色毛癬菌、白念珠菌和短帚霉摸索反應(yīng)條件和驗證體系的適用性；并用紅色毛癬菌來測定反應(yīng)的靈敏度。結(jié)果1.所采用的真菌通用引物28SrDNA、皮膚癬菌特異性引物ACT和酵母特異性引物ACT1有較好的通用性和特異性；2.在適宜的反應(yīng)條件下，無論對單模板，還是多模板，該反應(yīng)體系均能擴增出目的片段，

14、未見明顯非特異片段的干擾；3.該反應(yīng)體系對模擬臨床標本的檢測靈敏度為102cfu/ml。結(jié)論多重RT-PCR技術(shù)可在較短時間內(nèi)檢測出皮膚癬菌，酵母和非皮膚癬菌的絲狀菌等三類病原菌，并可衡量菌的活力，有利于判斷甲組織是否存在真菌的感染。 第四部分甲真菌病致病菌毒力相關(guān)因子的體外研究第一章甲真菌病分離菌株體外角蛋白酶活性的測定目的對甲真菌病常見致病菌及污染菌進行體外降解角蛋白能力的比較，以初步探討該病的臨床表現(xiàn)與角蛋白酶的相關(guān)性，為

15、該病發(fā)病機制及治療新途徑的研究提供參考。方法角蛋白酶的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含甲或大豆蛋白胨的培養(yǎng)基，測定的底物為keratin-azure，以A595nm值衡量角蛋白酶的活性。結(jié)果1.來自兩種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的菌株的角蛋白酶活性無顯著性差異；2.皮膚癬菌與非皮膚癬菌的角蛋白酶活性無顯著性差異；3.紅色毛癬菌角蛋白酶活性顯著高于其他受試真菌；4.不同SCIO積分段的甲真菌病紅色毛癬菌臨床分離株角蛋白酶活性的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論甲真菌病的發(fā)病與角蛋白酶

16、有一定相關(guān)性，但僅用角蛋白酶尚不能完全解釋該病的發(fā)病機制。 第二章甲真菌病分離菌株細胞外水解酶活性的測定目的對甲真菌病常見致病菌及污染菌進行細胞外水解酶活性的測定，以期發(fā)現(xiàn)可能與該病相關(guān)的毒力因子。方法誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含甲或大豆蛋白胨的培養(yǎng)基，細胞外水解酶譜的測定體系采用APIZYM。結(jié)果1.與1％大豆蛋白胨培養(yǎng)基相比，受試的參照菌株在含甲培養(yǎng)基中有3種酶(Phosphataseacid，Naphthol-AS-BI-phospho

17、hydrolase，β-glucuronidase)的活性增加有統(tǒng)計學(xué)意義；2.與非皮膚癬菌相比，來自于含甲培養(yǎng)基的皮膚癬菌有4種酶活性的增加有統(tǒng)計學(xué)意義：Esterase(C4)，EsteraseLipase(C8)，N-acetyl-β-glucosaminidase，a-mannosidase；3.與非紅色毛癬菌相比，來自于含甲培養(yǎng)基的紅色毛癬菌有1種酶(N-acetyl-β-glucosaminidase)活性的升高有統(tǒng)計學(xué)意義