外源性磷酸肌酸對未成熟心肌保護作用研究.pdf

1、研究背景:近20年來，心肌缺血再灌注損傷機制和心肌保護措施的研究取得了很大的進展，并促進了心血管外科的發(fā)展。然而，臨床上，一些嬰幼兒先天性心臟病，即使已成功地做了畸形矯治手術，但術后仍出現心功能不全，手術死亡率較高。有研究者指出，其一半原因應歸咎于不恰當的心肌保護。人們逐漸意識到廣泛應用于臨床，并對成人心肌有良好保護作用的冷晶體停跳液，在嬰幼兒未成熟心肌卻不太理想。未成熟心肌作為心肌發(fā)育學上一個獨特的階段與成熟心肌在形態(tài)結構、生理功能、

2、物質代謝及基因表達等方面存在一定差異，成熟心肌的保護方法不能機械地用于未成熟心肌。在嬰幼兒先天性心臟病手術中，由于心肌保護不當導致心功能不全是術后嬰幼兒早期死亡的主要原因之一。外源高能磷酸鹽能增強停跳液對成熟心肌的保護作用，但主要應用于成年動物實驗及冠狀動脈搭橋手術病人，而在未成熟心肌國內外研究尚少。此實驗旨在觀察磷酸肌酸(CP)對未成熟心肌的保護作用。探討其對未成熟心肌及心肌間質的保護機制以及對未成熟心肌細胞凋亡的影響，進一步提高未成

3、熟心肌的保護效果。本研究分為二個部分：動物實驗及臨床研究。 第一部分:動物實驗 實驗一外:源性磷酸肌酸對未成熟兔心肌的保護研究 目的:觀察外源性磷酸肌酸(CP)對未成熟心肌的保護作用。 方法:出生3～4周齡的健康新生新西蘭長耳大白兔18只，體重平均0.40kg，隨機分為3組，每組6只。Ⅰ組(對照組)：常規(guī)冷晶體心肌保護液組，建立Langendorff模型，灌流10min、工作心15min后，夾閉灌注管全心

4、停灌。主動脈根部灌注ThomasⅡ冷晶體心肌保護液，灌注壓5.3kPa，按15ml/kg每隔30分鐘灌注一次，共3次，間隔期采用局部降溫維持心肌溫度9～11℃，缺血90分鐘。恢復Langendorff灌注10min，轉為工作心模型15min，記錄血流動力學指標，取心肌標本保存。Ⅱ組(CP組)：給予含10mmol/LCP(2.5g/L的ThomasⅡ冷晶體心肌保護液，劑量和用法均同Ⅰ組。Ⅲ組(CP+冷血停搏液組)：收集兔血，稀釋；添加CP

5、10mmol/L(2.5g/L)、ThomasⅡ冷晶體心肌保護液與兔血配成4：1含血停搏液，夾閉灌注管全心停灌后，立即用冷血停跳液灌注，缺血期灌注方式同Ⅰ組。分別測量以下指標：血流動力學指標、心肌含水量(MWC)、磷酸肌酶(CK)、磷酸肌酶同功酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)漏出率、心室肌ATP、ADP、AMP含量、肌鈣蛋白T(cTnT)、心肌超微結構等。 結果:(1)血流動力學指標中，主動脈流量(AF)恢復率、冠脈流量(

6、CF)恢復率、心排量(CO)恢復率、左心室收縮壓(LVSP)恢復率、左心室舒張末壓(LVEDP)恢復率和±dp/dtmax恢復率CP組及CP+冷血停搏液組與對照組比較有明顯改善，CP組與CP+冷血停搏液組兩組比較無明顯差異；(2)心肌含水量(MWC)：CP組和CP+冷血停搏液組與對照組比較，再灌后含水量明顯減少；(3)CP組和CP+冷血停搏液組與對照組比較心肌乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、磷酸肌酶同功酶(CK-MB)、肌鈣蛋白

7、T(cTnT)漏出率明顯改善(P＜0.05)；(4)心肌組織ATP、ADP含量：CP組和CP+冷血停搏液組再灌后ATP含量與對照組比較明顯增高；(5)心肌超微結構：CP組和CP+冷血停搏液組與對照組比較，心肌超微結構損傷較輕。 結論:CP對缺血再灌注未成熟心肌具有明顯的保護作用，其機制是通過維持缺血期間能量供應，同時保護細胞膜的穩(wěn)定性。 實驗二:外源性磷酸肌酸對未成熟心肌的細胞凋亡及凋亡相關基因表達的影響 目的:

8、觀察外源性磷酸肌酸對未成熟心肌的細胞凋亡及凋亡相關基因表達的影響，從細胞凋亡及調控基因的角度探討CP保護未成熟心肌，減少心肌細胞凋亡的分子機制。 方法:出生3～4周齡的健康新生新西蘭長耳大白兔12只，體重平均0.40kg，隨機分為2組，每組6只。Ⅰ組(對照組)：常規(guī)冷晶體心肌保護液組，建立Langendorff模型，灌流10min、工作心15min后，夾閉灌注管全心停灌。主動脈根部灌注ThomasⅡ冷晶體心肌保護液，灌注壓5.3

9、kPa，按15ml/kg每隔30分鐘灌注一次，共3次，間隔期采用局部維持心肌溫度9～11℃，缺血90分鐘?；謴蚅angendorff灌注10min，轉為工作心模型15min，取心肌標本保存。Ⅱ組(CP組)：給予含10mmol/LCP(2.5g/L)的ThomasⅡ冷晶體心肌保護液，劑量和用法均同Ⅰ組。分別用缺口未端標記(TUNEL)和免疫組化技術檢測各組心肌細胞凋亡率及凋亡相關基因Bcl-2、Fas及FasL表達情況。 結果1、

10、TUNEL法顯示：CP可顯著降低心臟缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡發(fā)生率(6.4±2.97VS14.2±1.92，P＜0.01)。2、免疫組化顯示：參與心肌細胞凋亡相關基因Bcl-2、Fas及FasL在各組均有表達，CP組Bcl-2表達呈強陽性。而促凋亡因子Fas及Fas-L表達僅為弱陽性。3、實驗結果表明，CP組與對照組比較，在缺血再灌注后心肌細胞凋亡明顯減少，bcl-2基因蛋白的表達明顯增多，而fas、fasL基因蛋白的表達明顯減少，說

11、明在未成熟心肌，CP通過影響bcl-2、fas、fasL基因蛋白的表達而減少心肌細胞凋亡。 結論:CP可減輕心臟再灌注損傷引起心肌細胞凋亡，其機制可能為：增加心臟再灌注后心肌細胞抗氧化能力、減少氧自由基生成、減輕自由基損傷、增加對心肌細胞凋亡的抵抗力；同時，增加凋亡相關基因Bcl-2表達，降低Fas、FasL表達，從而減少心臟缺血再灌注損傷細胞凋亡。 第二部分:臨床研究外源性磷酸肌酸對嬰幼兒未成熟心肌的保護作用

12、目的:本研究旨在探討外源性磷酸肌酸(CP)對未成熟心肌的保護作用。 方法:1歲以內的先天性心臟病患者共12例，隨機分為2組，Ⅰ組(對照組)、Ⅱ組(CP組)。Ⅰ組(對照組)：常規(guī)冷晶體心肌保護液組，常規(guī)建立主動脈及上、下腔靜脈插管后開始體外循環(huán)，主動脈阻斷后根部灌注ThomasⅡ冷晶體心肌保護液，第一次按30ml/kg，以后按15ml/kg每隔30分鐘灌注一次，記錄血流動力學指標，取心肌標本保存。Ⅱ組(CP組)：給予含10mmol

13、/LCP(2.5g/L)的ThomasⅡ冷晶體心肌保護液，劑量和用法均同Ⅰ組。分別測量以下指標：記錄比較術前、后心率(HR)、記錄比較動脈收縮壓(SAP)、動脈舒張壓(DAP)、平均動脈壓(MAP)、右心房平均壓(MRAP)，VSD的直徑等臨床資料。術中記錄體外循環(huán)轉流時間、主動脈阻斷時間、主動脈開放后輔助循環(huán)的時間，記錄心室恢復跳動所需時間等心臟電生理指標。記錄并比較兩組術后24小時內正性肌力藥物多巴胺的用量。分別在術前、術畢、術后2

14、4小時抽取靜脈血測定肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌肌鈣蛋白T(cardiactroponinT，cTnT)的濃度。主動脈阻斷前及主動脈開放前心房肌ATP，ADP，AMP的變化。主動脈開放后5～10分鐘取心房肌組織作原位細胞凋亡檢測(Tunel)，取心室肌肉作透射電鏡觀察。 結果:術前年齡、體重、VSD大小、主動脈阻斷時間、VSD的直徑兩組比較無明顯差異，兩組動脈收縮壓(SAP)、動脈舒張壓(

15、DAP)、平均動脈壓(MAP)、右心房平均壓(MRAP)。術中體外循環(huán)轉流時間、主動脈開放后輔助循環(huán)的時間等各項生理指標資料比較亦無明顯差異、而比較心室復跳時間及術后24小時內多巴胺的用量有明顯差異(P＜0.05)。比較兩組術畢、術后24小時CK、LDH無差異。CK-MB、cTnT兩組比較有明顯差異。心肌ATP，ADP顯示缺血后其含量CP組高于對照組(P＜0.05)的變化。心室肌電鏡顯示對照組肌絲溶解、線粒體空泡變，而CP組肌絲清晰，排