EB病毒潛伏膜蛋白2A酵母表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)及其相關(guān)疾病病人血清的抗LMP2A抗體的檢測(cè).pdf

1、該研究用基因工程技術(shù)克隆了編碼EB病毒潛伏膜蛋白2AcDNA,并在畢氏酵母GS115中進(jìn)行表達(dá),同時(shí)對(duì)EB病毒相關(guān)腫瘤病人的血清進(jìn)行了抗LMP2A抗體的檢測(cè).主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:一、EB病毒潛伏膜蛋白2A cDNA的克隆及分析用PCR的方法從質(zhì)粒pPICC/LMP2A上擴(kuò)增出LMP2A第1個(gè)外顯子到第8個(gè)外顯子的全部編碼蛋白的基因,序列同EB病毒B95.8原型株LMP2A cDNA作同源比較,完全一致.然后用EcoRI、NotI分別

2、對(duì)克隆有LMP2A基因的質(zhì)粒pPICC/LMP2A和pPICZαA進(jìn)行雙酶切,T4連接酶將LMP2A基因片斷與線性化的pPICZαA連接,構(gòu)建成重組的分泌型酵母表達(dá)載體pPICZαA/LMP2A.二、EB病毒潛伏膜蛋白2A畢氏酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)SacI限制型內(nèi)切酶酶切使之線性化后,再用氯化鋰轉(zhuǎn)化法將線性化的pPICZαA/LMP2A質(zhì)粒導(dǎo)入畢氏酵母菌株GS115,并以同源重組的形式整合到酵母染色體的AOX位點(diǎn),經(jīng)Zeocine抗性

3、篩選陽(yáng)性克隆.菌落PCR對(duì)酵母轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行鑒定后,挑取陽(yáng)性克隆在含甲醇的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá),并于培養(yǎng)的第24h,48h,72h分別吸出酵母上清,離心后進(jìn)行12％SDS-PAGE和Western-blotting分析鑒定LMP2A的表達(dá)情況,得到能在甲醇誘導(dǎo)下穩(wěn)定分泌LMP2A的基因工程菌GS115/pPICZα/LMP2A.三、LMP2A的大規(guī)模發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)、純化和鑒定應(yīng)用全自動(dòng)發(fā)酵裝置進(jìn)行發(fā)酵,經(jīng)陰離子交換層析方法分離、純化,獲得分子量約