肝素治療膿毒癥的效果評價及窖蛋白-1在其抗炎過程中的作用.pdf

1、膿毒癥（sepsis）被定義為感染及其導致的全身炎癥反應綜合征(SIRS)，炎癥反應的過度激活及免疫失衡是膿毒癥的本質特征，因此，在膿毒癥早期控制促炎因子的過度釋放、恢復免疫平衡，從而達到保護器官功能，改善預后的目的，這已成為膿毒癥研究的核心問題。
　　普通肝素(unfractioned heparin，UFH)抗凝效果確切，在臨床上廣泛應用于防治血栓栓塞性疾病、DIC的早期治療。除此之外，肝素還具有廣泛的抗炎作用，可明顯降低炎癥

2、介質表達，降低凝血活化，保護內皮細胞完整性，從而可能降低膿毒癥病人的多器官功能障礙的發(fā)生及病死率。而針對膿毒癥病人的3個有關抗凝劑的大樣本Ⅲ期臨床試驗的安慰劑組病例分析同樣表明，肝素組較未應用肝素組似乎有更高的生存率。雖然近年來，臨床應用肝素治療膿毒癥的隨機對照實驗開始出現，但針對其有效性及安全性的評估結果并不一致。
　　目前，肝素并未作為抗炎藥物應用于臨床，除了對其出血的不良反應的擔憂，對其復雜抗炎機制的認識不足也是一個重要原因

3、。肝素抗炎作用的機制和確切作用位點尚不完全清楚。作為帶負電荷的大分子物質，肝素通過胞吞作用進入細胞內十分緩慢，低濃度時甚至尚未形成完成的囊泡便已被降解代謝。有證據表明，低至1μg/ml的肝素可在2分鐘以內通過調控細胞表面的Erk及鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(CaMK)活化產生作用，而與細胞內蛋白激酶R的直接結合作用需要100μg/ml的肝素72小時以后才能發(fā)揮作用。因此，低劑量肝素的效果至少部分應作用于細胞外。
　　胞膜窖是細胞膜上富

4、含膽固醇和鞘磷脂的壺腹狀凹陷，參與了廣泛的細胞作用過程。窖蛋白是胞膜窖的外殼蛋白，屬于嵌膜蛋白質(integral membrane protein)家族成員，在不同的細胞中有些特定的功能，而窖蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)可能是體內炎癥細胞潛在的重要免疫調節(jié)分予，并且在炎癥信號傳導過程中處于軸心位置，這其中包括巨噬細胞。有文獻報道，不同免疫細胞所表達的Cav-1在感染或炎癥反應中發(fā)揮了極其重要的調節(jié)作用。
　　有趣

5、的是，有文章報道，肝素能夠調控Cav-1的表達和亞細胞定位，然而在炎癥過程中，他們之間是否存在相關性尚未被證實。揭示Cav-1參與炎癥反應中的調控機制能夠進一步理解Cav-1的功能，以幫助我們尋找治療與炎癥相關疾病新的靶點。
　　材料和方法:
　　一、研究對象
　　論文一針對肝素治療膿毒癥病人的有效性及安全性進行系統(tǒng)綜述，通過計算機檢索MEDLINE數據庫、Cochrane圖書館、科學引文索引擴展板數據庫(SCIE)、

6、中國生物醫(yī)學文獻數據庫(CBM)、中國知識基礎設施工程數據庫(CNKI)、維普數據庫、萬方數據庫，檢索時限均從2000年1月至2012年6月，納入肝素治療膿毒癥的隨機對照臨床試驗17個，共1167例膿毒癥病人。
　　論文二、論文三及中實驗用小鼠腹腔巨噬細胞均分離自未注射刺激物的C57BL/6小鼠。
　　二、實驗材料
　　DMEM培養(yǎng)基、PBS、FBS、LPS、普通肝素、SB203580、NP-40裂解液、PMSF、BC

7、A蛋白濃度測定試劑盒、一抗二抗去除液、TEMED、預染蛋白分子量標準、PVDF膜、ECL發(fā)光液、BSA、脫脂奶粉、羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP、Mouse antiβ-actin-HRP、胎牛血清、脂質體2000、Super M-MLV反轉錄酶、RNAsimple Total RNA Kit、RNase固相清除劑、Powder瓊脂糖、50×TAE、2×Power TaqPCR MasterMix、SYBR Green、小

8、鼠TNF-α、IL-6、IL-8及IL-1β ELISA檢測試劑盒。
　　三、實驗方法
　?。ㄒ唬┖Y選所有符合納入標準的肝素治療膿毒癥的RCT研究，并采用Cochrane系統(tǒng)評價員手冊5.1.0推薦的質量評價方法對其進行質量評價，對28天病死率、出血、凝血指標變化、住院時間、病情改善及器官保護進行數據提取，采用Revman5.1進行系統(tǒng)評價。
　?。ǘ〦LISA檢測炎癥因子蛋白表達情況;Western blot檢測c

9、aveolin-1蛋白及MAPK信號分子蛋白表達;siRNA轉染下調caveolin-1表達;RT-PCR檢測caveolin-1及炎癥因子mRNA轉錄情況。
　　四、統(tǒng)計學分析
　　論文一統(tǒng)計學分析采用Revman5.1軟件完成。結果數據以均值±標準差表示，所有原始數據使用單向方差分析進行(ANOVA)，然后通過Bonferroni檢驗進行多組兩兩比較。P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　一、肝素

10、治療膿毒癥的有效性及安全性
　　1、與對照組相比，肝素能顯著降低膿毒癥患者28天病死率，其差異具有統(tǒng)計學意義[OR=0.59，95 CI(0.45，0.77)，P=0.0001]。
　　2、小劑量肝素治療的病例中嚴重出血發(fā)生率很低。
　　3、肝素治療未導致血小板計數明顯下降，相反有助于糾正血小板降低[MD=13.94，95 CI(10.15，17.72)，P＜0.00001]，肝素對PT及APTT影響與對照組無統(tǒng)計學差

11、異。
　　4、肝素對病人住院時間無明顯影響，但可縮短住ICU時間[MD=-4.43，95 CI(-6.79,-2.07),P=0.0002]。
　　5、肝素治療后膿毒癥病人APACHEⅡ評分明顯降低[MD=-2.58，95 CI(-3.29，-1.87)，P＜0.00001]，MODS發(fā)生率明顯降低[OR=0.32，95 CI(0.17，0.61)，P=0.0006]。
　　二、肝素通過p38 MAPK通路抑制脂多糖誘

12、導的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥細胞因子轉錄與表達
　　1、與對照組相比，100ng/ml LPS可誘導小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度分別增高2.74，4.30，4.04和4.54倍，mRNA轉錄分別增高2.28，2.52，1.99和2.84倍。
　　2、與單純LPS刺激組比較，同時加用20μg/ml肝素能夠使TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度分別降低37.4，45.5％，42％和35.7

13、％，mRNA轉錄水平也相應被抑制36％，35.7％，36.7％和44.4％，單純加用肝素對TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度及mRNA轉錄均無明顯影響。
　　3、與對照組相比，100ng/ml LPS刺激下，巨噬細胞p-ERK、p-JNK、p-p38濃度明顯升高1.66，1.94和2.72倍，但ERK，JNK和p38 MAPK均無明顯變化。與單純LPS刺激組比較，同時加用20μg/ml肝素能夠使p-p38上升1.56倍

14、，卻使p-JNK下降41.3％，而對p-ERK無明顯影響。
　　4、與LPS+DMSO組相比，同時加用肝素能夠使TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度分別降低41.7％，52.2％，44.1％，41.9％;與LPS+DMSO+肝素組比較，LPS+肝素+SB203580組TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度明顯增高(p＜0.05)，與LPS+DMSO組無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)，SB203580明顯減弱了肝素抑制

15、炎癥因子表達的作用。
　　三、caveolin-1是肝素抑制LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥細胞因子表達的關鍵分子
　　1、成功構建siRNA介導caveolin-1低表達巨噬細胞，與陰性對照及正常對照巨噬細胞相比，caveolin-1蛋白及mRNA表達分別下降75％和80％。
　　2、陰性對照及Cav-1低表達巨噬細胞在LPS誘導下，炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度均明顯升高，而且Cav-1

16、低表達巨噬細胞炎癥因子表達水平比陰性對照細胞更高，然而，后者能夠被肝素明顯抑制，而前者卻不明顯。單獨給予肝素對轉染的巨噬細胞炎癥因子表達無明顯影響。
　　3、在等量肝素作用下，p-p38 MAPK在正常及陰性對照巨噬細胞的表達無差異，而在Cav-1低表達巨噬細胞表達下降49％。
　　結論:
　　1、小劑量肝素可降低膿毒癥病人的病死率，改善預后，且安全性較高。
　　2、LPS誘導上調小鼠腹腔巨噬細胞炎癥因子TNF-