HDAC1和HDAC2在羅哌卡因緩解CCI大鼠慢性疼痛的機(jī)制中的應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　局麻藥目前已被廣泛用于手術(shù)麻醉和急性疼痛治療。最近的臨床和基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射局麻藥也可以緩解神經(jīng)病理性疼痛，但是其具體機(jī)制不清。因為鈉通道阻滯被認(rèn)為是局麻藥的主要的作用機(jī)制，而鞘內(nèi)注射低于鈉通道阻滯的濃度的局麻藥即獲得緩解神經(jīng)病理性的效果，而且局麻藥的鎮(zhèn)痛作用維持時間長于藥物半衰期。
　　越來越多的證據(jù)支持表觀遺傳學(xué)機(jī)制參與了神經(jīng)病理性疼痛的形成過程。神經(jīng)病理性疼痛的重要特征是神經(jīng)元的可塑性改變，不可再生的神經(jīng)

2、元細(xì)胞可塑性改變主要依賴于表觀遺傳學(xué)機(jī)制;而且，長期記憶和慢性疼痛的機(jī)制類似，長時程記憶中的表觀遺傳學(xué)改變可能同樣適用于慢性疼痛。
　　本實驗分兩部分，第一部分?jǐn)M證實連續(xù)鞘內(nèi)注射0.25％的羅哌卡因有緩解慢性疼痛作用建立了坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型，第二部分?jǐn)M分子水平探索CCI手術(shù)后不同時間點(diǎn)神經(jīng)病理性疼痛調(diào)節(jié)中樞—脊髓去乙?；降淖兓扒蕛?nèi)注射0.25％羅哌卡因?qū)@種變化的影響。此外還初步探索了去乙酰化酶可能的作用的位點(diǎn)GDNF。

3、>　　方法:
　　1.鞘內(nèi)置管成功5天后的成年雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為3組:Sham+NS組(n=10)，CCI+NS組(n=10)和CCI+Ropivacaine組(n=10)。Sham+NS和CCI+NS組術(shù)后第7～13天連續(xù)7天注射生理鹽水;CCI+Ropivacaine組手術(shù)后連續(xù)7天注射0.25％羅哌卡因;術(shù)前1，3天及術(shù)后3、7、10、14、15、16、17、21天分別對左右足掌“花環(huán)”中央的機(jī)械痛閾和熱痛閾進(jìn)行評

4、價，第7、10天行為學(xué)于鞘內(nèi)注射前測量。術(shù)后第14天處死大鼠，取腰膨大組織用于后續(xù)分子生物學(xué)研究。
　　2.體重200～250g的成年雄性SD大鼠35只，隨機(jī)分為3組:Na(i)ve組(n=5)，不做任何處理;Sham組(n=15)，僅暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)而不結(jié)扎;CCI組(n=15)，按Bennett和Xie的方法建立左側(cè)CCI模型。術(shù)前1，3天及術(shù)后3、7、10、14、21天分別對左右足掌“花環(huán)”中央的機(jī)械痛閾和熱痛閾進(jìn)行評價。于

5、術(shù)后7，10，14天處死大鼠，取腰膨大組織，和前一部分用于Western blot的標(biāo)本一起用于檢測I類組蛋白去乙?；?組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)和組蛋白去乙?；?(HDAC2);以及膠質(zhì)細(xì)胞源性生長因子GDNF在脊髓中的蛋白表達(dá)水平。于術(shù)后14天處死大鼠，灌注固定后行冰凍切片和前一部分用于免疫熒光的標(biāo)本一起進(jìn)行HDAC1，HDAC，GDNF的免疫熒光染色及HDAC1、HDAC2熒光雙標(biāo)進(jìn)行細(xì)胞定位。
　　結(jié)果:

6、　　1.三組大鼠術(shù)前痛閾無明顯區(qū)別(P＞0.05)。與Sham+NS組比較，CCI+NS組機(jī)械痛閾和熱痛閾降低(P＜0.05)。與CCI+NS比較，CCI+Ropi組在羅哌卡因注射后的CCI術(shù)后D14、D15天機(jī)械痛閾和D10天、D14、D15天熱痛閾有所增加，(p＜0.05)但此后D16，D17、D21天的痛閾差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與CCI+NS組比，D14天脊髓HDAC1 HDAC2的蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)，而GD

7、NF蛋白表達(dá)則增加(P＜0.05)。CCI+Ropi組D14天脊髓背角HDAC1、HDAC2免疫熒光的陽性細(xì)胞數(shù)增加(P＜0.05);
　　2.三組大鼠術(shù)前機(jī)械痛和熱痛閾差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Sham組和na(i)ve組熱痛閾和機(jī)械痛閾無明顯變化(P＞0.05)。與Sham組相比，CCI組第3天開始出現(xiàn)機(jī)械痛閾和熱痛閾的降低，第14天達(dá)峰，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);CCI組脊髓HDAC1，HDAC2蛋白表達(dá)量較Sham組增加，有統(tǒng)

8、計學(xué)意義(P＜0.05) GDNF蛋白表達(dá)量較Sham組減少(P＜0.05);CCI組第14天標(biāo)本脊髓背角HDAC1，HDAC2免疫熒光陽性細(xì)胞數(shù)目較sham組增加(P＜0.05)，而GDNF免疫熒光陽性面積比Sham組減少(P＜0.05)
　　結(jié)論:
　　1.CCI大鼠術(shù)后逐漸出現(xiàn)明顯的痛覺敏感，脊髓腰膨大HDAC1、HDAC2蛋白表達(dá)量的變化與行為學(xué)變化基本一致，GDNF表達(dá)量與行為學(xué)變化相反。
　　2.鞘內(nèi)連續(xù)注