食管癌高發(fā)區(qū)食管鱗癌與HPV、HLA-G和Lin28b的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　 食管癌是嚴(yán)重威脅人類健康的最常見(jiàn)的胸部惡性腫瘤之一。全世界每年新發(fā)食管癌病例大約為40萬(wàn)，死亡病例約為30萬(wàn)，大部分食管癌患者發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。我國(guó)是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家和地區(qū)之一。20世紀(jì)90年代以來(lái)，我國(guó)食管癌的發(fā)病率、死亡率有所下降，但在河南北部地區(qū)和廣東潮汕地區(qū)，食管癌仍居當(dāng)?shù)馗鞣N惡性腫瘤死亡原因的第一位;河南新鄉(xiāng)地區(qū)、廣東潮州地區(qū)均屬于我國(guó)食管癌高發(fā)地區(qū)。在我國(guó)鱗狀細(xì)胞癌(squamo

2、uscellcarcinoma)是食管癌最主要的病理組織學(xué)類型。對(duì)食管癌特別是食管鱗狀上皮細(xì)胞癌的研究仍是我國(guó)胸外科工作者研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。食管鱗狀上皮細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是長(zhǎng)時(shí)期多因素（霉菌感染、不良飲食習(xí)慣、吸煙、飲酒、微量元素缺乏和環(huán)境污染等）相互作用、多種相關(guān)基因或獨(dú)立基因（如癌基因、抑癌基因、凋亡抑制因子等）分子改變參與，其先后或同時(shí)發(fā)生的積累和疊加作用并最終作用于細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的紊亂、細(xì)胞增殖失控、基因受損突

3、變導(dǎo)致正常上皮經(jīng)過(guò)各級(jí)癌前病變而最終發(fā)展為浸潤(rùn)性癌腫。雖然根據(jù)目前對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，應(yīng)用研究出的靶向藥物治療惡性腫瘤取得了一些進(jìn)展，但是目前腫瘤癌變多階段演進(jìn)過(guò)程中重要關(guān)鍵性的DNA基因突變及某些分子事件及其相互關(guān)系還不十分清楚，尋找、確定腫瘤演進(jìn)過(guò)程中共同的起關(guān)鍵作用的基因、蛋白和環(huán)節(jié)并將其應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防、早期診斷和治療，最終征服腫瘤，還需要進(jìn)行大量艱苦的工作。
　　 由于惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制目前仍未能徹底搞清，所以腫瘤

4、預(yù)防和治療的效果仍很不理想，仍需廣大醫(yī)學(xué)工作者繼續(xù)不斷探索、研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和有效治療。近來(lái)，除環(huán)境、飲食和遺傳等因素外，高?；騺喰腿巳轭^狀瘤病毒(HPV)感染與腫瘤的關(guān)系越來(lái)越受到關(guān)注。人乳頭狀瘤病毒屬乳多空病毒科A亞群的一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，為無(wú)包膜的20面體對(duì)稱病毒，直徑約45-55nm?，F(xiàn)多根據(jù)不同基因亞型HPV與惡性腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性高低分為低危險(xiǎn)型和高危險(xiǎn)型HPV。正常細(xì)胞DNA由于受到HPV的基因組的整合可能會(huì)導(dǎo)致癌

5、基因激活，如Ras等使細(xì)胞永生化，經(jīng)長(zhǎng)期傳代后激活癌基因。E6和E7癌基因是HPV的主要癌基因。當(dāng)HPV病毒整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組中，既可以逃避宿主免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視和免疫殺傷，而且整合的E6、E7癌基因與相鄰的基因組共同轉(zhuǎn)錄，可以使轉(zhuǎn)錄更加穩(wěn)定;體外研究證實(shí)高危型HPV編碼產(chǎn)生的E6、E7癌蛋白能有效導(dǎo)致人體細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)。尤其是高危型HPV16、18基因亞型產(chǎn)生的癌蛋白可抑制p53和Rb等，使其喪失抑制細(xì)胞生

6、長(zhǎng)的效應(yīng)，激活端粒酶致，使HPV感染的細(xì)胞不斷分裂生長(zhǎng)，處于異常增殖狀態(tài)，從而使細(xì)胞避免凋亡而永生化，進(jìn)而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。HPV感染機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)存在，需要逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊，才能發(fā)揮重要的致瘤致癌作用。人類白細(xì)胞抗原G(HLA-G)屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰb類分子，是一種重要的免疫耐受分子。HLA-G在正常體細(xì)胞中不表達(dá)，主要在人類正常妊娠母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)，通過(guò)抑制NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等，來(lái)保護(hù)胚胎免受母體免疫系統(tǒng)的攻

7、擊。目前的研究發(fā)現(xiàn)HLA-G在乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，表明HLA-G可能在腫瘤的免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。Lin28是AmbrosV等在秀麗隱桿線蟲(chóng)中首先發(fā)現(xiàn)的，其具有調(diào)節(jié)線蟲(chóng)發(fā)育的時(shí)序性作用的RNA結(jié)合蛋白;Lin28通過(guò)抑制Let-7在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，進(jìn)而作用于細(xì)胞周期，控制細(xì)胞的增殖、分裂和分化;是調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的一個(gè)重要因子。Lin28在鼠和人胚胎干細(xì)胞中呈高表達(dá)，并且隨著干細(xì)胞誘導(dǎo)不斷分化其

8、表達(dá)逐漸降低;在腫瘤組織中則反常高表達(dá)。Lin28b是Lin28的同源異構(gòu)體，主要在干細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。目前對(duì)于HPV感染在食管癌變過(guò)程中怎樣發(fā)揮作用，HLA-G、Lin28b在食管癌發(fā)生中是否起作用尚不清楚。HPV與HLA-G、Lin28b在食管癌變過(guò)程中的相互關(guān)系等尚不可知;本研究擬探討HLA-G、Lin28b和HPV在食管鱗癌組織中的表達(dá)和相互關(guān)系。
　　 本文分兩章，分別闡釋如下:
　　 第一章新鄉(xiāng)地區(qū)食

9、管鱗癌與HPV、HLA-G和Lin28b的相關(guān)性研究
　　 1.目的:
　　 研究人乳頭狀瘤病毒（HPV）在新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁正常食管組織中的感染情況;
　　 研究HLA-G在新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁正常食管組織中陽(yáng)性表達(dá)的情況;
　　 研究RNA結(jié)合蛋白Lin28b在新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌、癌旁正常食管組織中陽(yáng)性表達(dá)的情況;
　　 研究新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌病人的年齡、性別

10、、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與鱗癌組織中感染HPV、HLA-G陽(yáng)性表達(dá)和Lin28b陽(yáng)性表達(dá)之間的關(guān)系;
　　 研究新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌組織感染HPV與HLA-G表達(dá)、Lin28b表達(dá)之間的關(guān)系。
　　 2.方法:
　　 采用基因?qū)Я餍酒夹g(shù)，應(yīng)用潮州凱普生化公司HPV基因分型檢測(cè)試劑盒（包括13種高危亞型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，5種低危亞

11、型HPV6、11、42、43和44和3種中國(guó)人群常見(jiàn)亞型HPV53、66和CP8304），檢測(cè)114例食管鱗狀細(xì)胞癌組織及50例癌旁正常食管組織中HPV基因亞型感染的情況，
　　 采用免疫組織化學(xué)非生物素二步法檢測(cè)，用鼠抗人HLA-G單克隆抗體(1:150)和兔抗人Lin28b單克隆抗體(1:100)對(duì)114例食管鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除石蠟標(biāo)本、50例癌旁正常食管上皮的石蠟標(biāo)本組織切片進(jìn)行染色、觀察，評(píng)定HLA-G和Lin28b陽(yáng)性

12、表達(dá)的情況。
　　 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。HPV感染、HLA-G、Lin28b在食管鱗癌和正常食管組織中表達(dá)的比較、與食管鱗癌組織臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用x2檢驗(yàn)或Fisher's精確概率法。HPV感染與HLA-G、Lin28b兩指標(biāo)間的關(guān)系采用四格表x2檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)。HPV亞型感染與HLA-G、Lin28b兩指標(biāo)間的關(guān)系采用列聯(lián)表x2檢驗(yàn)法。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05（雙側(cè)），以P＜0

13、.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.結(jié)果
　　 新鄉(xiāng)地區(qū)114例食管鱗癌組織及50例癌旁正常食管組織中人乳頭狀瘤病毒感染陽(yáng)性率分別為63.2％和6％(72/114，3/50)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=45.753，P＜0.001);食管鱗癌存在HPV16、18和52三種亞型感染，HPV16感染率最高，HPV52感染率最低，未發(fā)現(xiàn)多重HPV基因亞型感染。HPV感染率隨食管鱗癌細(xì)胞分化程度的降低而增高(x2=6.793，

14、P=0.009)，與患者的年齡、性別、腫瘤浸潤(rùn)的深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 HLA-G陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要位于細(xì)胞質(zhì)。HLA-G在食管鱗癌及食管正常上皮的陽(yáng)性表達(dá)率分別為51.8％(40/114)和0(0/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=40.418，P＜0.001)。HLA-G蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率隨食管鱗癌細(xì)胞分化程度的降低而增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=12.131，P＜0.001）。HLA-G陽(yáng)性表達(dá)率與

15、食管癌患者的年齡、性別、腫瘤浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 Lin28b的陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要位于細(xì)胞質(zhì)。Lin28b在新鄉(xiāng)地區(qū)114例食管鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常食管組織66.7％vs2％(40/114，1/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=62.121，P＜0.001);Lin28b的陽(yáng)性表達(dá)率隨食管鱗癌細(xì)胞分化程度的降低而增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=11.225，P=0.001);Lin28

16、b的陽(yáng)性表達(dá)率隨腫瘤浸潤(rùn)深度的進(jìn)展而增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.342，P=0.037);Lin28b的陽(yáng)性表達(dá)率隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=21.658，P＜0.001)。Lin28b陽(yáng)性表達(dá)率與患者的年齡、性別無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中HPV陽(yáng)性組中HLA-G陽(yáng)性率顯著高于HPV陰性組(x2=11.525，P=0.001)。HPV與HLA-G存在一定正相關(guān)關(guān)系，但不密切(r

17、s=0.318)。
　　 在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中HPV陽(yáng)性組中Lin28b陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于HPV陰性組(x2=13.741，P＜0.001)。HPV與Lin28b存在一定正相關(guān)關(guān)系，但不密切(rs=0.347)。
　　 第二章新鄉(xiāng)和潮州地區(qū)食管鱗癌與人乳頭狀瘤病毒基因亞型感染的相關(guān)性研究
　　 1.目的:
　　 研究人乳頭狀瘤病毒(HPV)基因亞型在潮州地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁正常食管組織中的感染情

18、況;人乳頭狀瘤病毒基因亞型在新鄉(xiāng)和潮州兩地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的感染情況是否有差異。
　　 2.方法:
　　 采用基因?qū)Я餍酒夹g(shù)，應(yīng)用潮州凱普生化公司HPV基因分型檢測(cè)試劑盒（包括13種高危亞型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，5種低危亞型HPV6、11、42、43和44以及3種中國(guó)人群常見(jiàn)亞型HPV53、66和CP8304）分別對(duì)新鄉(xiāng)地區(qū)114例和潮州地區(qū)105例食

19、管鱗癌組織、各50例癌旁正常食管組織（均已經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋處理）進(jìn)行HPV亞型檢測(cè)。
　　 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。HPV感染與食管鱗癌組織、臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用x2檢驗(yàn)或Fisher's精確概率法。兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05（雙側(cè)），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.結(jié)果:
　　 在新鄉(xiāng)和潮州兩地區(qū)219例食管鱗癌組織中，HPV感

20、染的總陽(yáng)性率為49.8％;新鄉(xiāng)地區(qū)114例食管鱗癌組織及50例癌旁食管正常組織中HPV感染的陽(yáng)性率分別為63.2％和6％(72/114，3/50)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=45.753，P＜0.001);潮州地區(qū)食管鱗癌組織中的HPV陽(yáng)性感染率顯著高于正常食管粘膜組織35.2％vs4％(37/105，2/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=17.552，P＜0.001)。新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗癌組織HPV的陽(yáng)性檢出率高于潮州地區(qū)(63.2％vs3

21、5.2％)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=17.043，P＜0.001)。在新鄉(xiāng)和潮州地區(qū)食管鱗癌組織中HPV16的陽(yáng)性率分別為34.2％和23.8％，HPV18的陽(yáng)性率分別為16.7％和11.4％，HPV52的陽(yáng)性率分別為12.3％、0。未檢出其它HPV基因亞型感染及多重基因亞型感染。
　　 新鄉(xiāng)地區(qū)HPV感染率隨食管鱗癌細(xì)胞分化程度的降低而增高(x2=6.793，P=0.009)，HPV感染率與患者年齡、性別、腫瘤浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)

22、轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P＞0.05);潮州地區(qū)HPV感染率與患者年齡、性別、腫瘤分化、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.新鄉(xiāng)和潮州地區(qū)食管鱗癌組織中都存在人乳頭狀瘤病毒感染;新鄉(xiāng)地區(qū)HPV感染為HPV16、18和52基因亞型，而潮州地區(qū)為HPV16、18基因亞型;不同食管鱗癌高發(fā)區(qū)感染HPV基因亞型可能不同。
　　 2.HLA-G陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要位于食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì);HLA-G蛋

23、白的陽(yáng)性表達(dá)率與食管鱗癌細(xì)胞的分化程度有關(guān)。
　　 3.Lin28b陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要位于食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì);Lin28b的陽(yáng)性表達(dá)率與食管癌患者腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 4.食管鱗癌感染HPV與Lin28b、HLA-G存在一定正相關(guān)關(guān)系。
　　 5.HPV、HLA-G與Lin28b可能在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，但其在食管鱗癌惡變過(guò)程中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
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