免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子4在乳腺癌中的表達(dá)及其調(diào)節(jié)B7-H3表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 近15年來我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，且發(fā)病年齡越來越趨于年輕化，嚴(yán)重威脅女性的健康。研究表明免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)可直接影響乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。明確影響免疫系統(tǒng)狀態(tài)關(guān)鍵分子，不僅可豐富腫瘤發(fā)生的理論基礎(chǔ)，還可為乳腺癌患者提供個體化的預(yù)防和治療方案。所以，尋找和研究促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的免疫系統(tǒng)功能性分子已成為目前腫瘤免疫領(lǐng)域研究的熱點。
　　 目前認(rèn)為，免疫逃逸是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的

2、重要環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)抑制性分子促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸越來越受到重視。免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子(Immunoglobulin-liketranscript,ILT)4(又稱為LILRB2、MIR10、LIR-2、CD85d)是ILT家族中的一員，因其蛋白胞外區(qū)含有4個免疫球蛋白區(qū)，所以又屬于免疫球蛋白超家族。其胞內(nèi)區(qū)為含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)的長胞質(zhì)尾部，可募集含SH2結(jié)構(gòu)的酪氨酸磷酸激酶SHP-1和SHP-2發(fā)揮細(xì)胞外信號向細(xì)

3、胞內(nèi)傳遞的作用，因而被認(rèn)為是一種免疫抑制性受體。以往的研究已證實，ILT4主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞上，在維持母胎免疫耐受、炎癥和移植耐受方面發(fā)揮重要的免疫抑制作用。
　　 迄今為止，對ILT4及同類分子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況知之甚少，其在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的作用及機(jī)制更不清楚。初步研究發(fā)現(xiàn)ILT4在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，ILT2在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中高表達(dá)，ILT3、ILT4在慢性淋巴性白血病中的惡性B細(xì)胞上高表達(dá)，且ILT

4、3與淋巴組織中惡性B細(xì)胞的浸潤有關(guān)。ILT3在胃癌細(xì)胞和產(chǎn)蛋雌雞的自發(fā)性卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，且與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)，但其在乳腺癌中的表達(dá)情況和機(jī)制尚不明確。
　　 樹突狀細(xì)胞(DC)與CD8+Ts細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)其表面ILT4的表達(dá)增高，共刺激分子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)的表達(dá)減少，刺激CD4+Th細(xì)胞活化、增殖的能力減弱。無獨有偶，在敲除小鼠同源性配對免疫球蛋白樣受體PIRB的巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，NF-κB途徑被活

5、化，其下游分子B7-1、B7-2表達(dá)增高，上述研究表明在抗原遞呈細(xì)胞中ILT4可通過某個信號途徑下調(diào)B7家族共刺激分子B7-1和B7-2，減弱T細(xì)胞活化所需的第2信號。B7-H3是B7共刺激分子家族中的一員，最初被認(rèn)定為共刺激分子，然而近來越來越多的研究證實了它在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可以抑制T細(xì)胞活化，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)B7-H3在乳腺癌細(xì)胞上高表達(dá)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ILT4也可高表達(dá)于乳腺癌，同時也發(fā)現(xiàn)ILT4和B7-H3可共同

6、表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞上。那么乳腺癌中ILT4和B7-H3的表達(dá)之間是否存在相關(guān)性？在乳腺癌細(xì)胞中ILT4是否可以調(diào)節(jié)B7-H3的表達(dá)？基于上述研究目的，本課題通過免疫組化檢測117例原發(fā)性乳腺癌組織中ILT4和B7-H3的表達(dá)水平，分析二者與患者臨床病理因素、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TILs)及IL-10的相關(guān)性，特別是二者之間的相關(guān)性;通過RT-PCR和WestemBlot檢測乳腺癌細(xì)胞株中ILT4及B7-H3的mRNA及蛋白表達(dá)情況;在體外

7、通過基因轉(zhuǎn)染和shRNA干擾兩種技術(shù)使ILT4過表達(dá)或ILT4基因沉默，檢測ILT4對乳腺癌細(xì)胞中B7-H3的調(diào)節(jié)作用，以期探討ILT4在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用，為乳腺癌的治療提供新思路。
　　 研究方法：
　　 1.采用免疫組化法檢測117例原發(fā)性乳腺癌患者中ILT4、B7-H3及IL-10在蛋白水平的表達(dá)情況;檢測CD45RO的表達(dá)，并計數(shù)腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞的數(shù)量。
　　 2.pEZ-ILT4質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染

8、SK-BR-3細(xì)胞株，使ILT4過表達(dá)。通過RT-PCR和WesternBlot檢測該細(xì)胞株中B7-H3的mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 3.pGPU6-shILT4質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞株，使ILT4基因沉默。通過RT-PCR和WesternBlot檢測該細(xì)胞株中B7-H3的mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 4.采用SPSS統(tǒng)計學(xué)分析軟件15.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，認(rèn)為p＜0.05有顯著性差異。乳腺癌組織ILT4、

9、B7-H3及IL-10與臨床病理因素的相關(guān)性采用chi-square檢驗。ILT4、B7-H3與IL-10的相關(guān)性及二者之間的相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析。TILs的數(shù)量用x±s表示，兩樣本均數(shù)的比較采用獨立樣本不配對t檢驗。乳腺癌細(xì)胞株mRNA和蛋白的相對表達(dá)量以(x)±s表示，兩樣本間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。
　　 結(jié)果：
　　 1.ILT4在人乳腺癌組織及轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結(jié)中的表達(dá)及其與臨床病理因素的相關(guān)性<

10、br>　　 在原發(fā)性乳腺癌組織中ILT4可表達(dá)在胞漿、胞膜上或二者均表達(dá)，而在周圍正常的乳腺組織中不表達(dá)。在117例乳腺癌標(biāo)本中，71例表達(dá)ILT4(60.7％)。形態(tài)學(xué)上也發(fā)現(xiàn)ILT4可表達(dá)于腫瘤間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和漿細(xì)胞上。在轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結(jié)中，72枚(74.2％)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中癌細(xì)胞上表達(dá)ILT4。ILT4表達(dá)在胞漿、胞膜上或二者均表達(dá);其對應(yīng)的原發(fā)腫瘤組織均有ILT4表達(dá)，在25枚ILT4表達(dá)陰性的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中，24枚

11、相應(yīng)的原發(fā)腫瘤組織ILT4表達(dá)為陰性，另一枚相應(yīng)的原發(fā)腫瘤組織中ILT4的表達(dá)強(qiáng)度為10-40％。同時在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的間質(zhì)細(xì)胞上也發(fā)現(xiàn)ILT4的陽性表達(dá)。乳腺癌組織中ILT4的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(p=0.046)，與年齡、組織學(xué)類型、腫瘤大小、腫瘤學(xué)分期、分化程度及受體表達(dá)情況均無明顯的相關(guān)性。
　　 2.B7-H3在人乳腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素的相關(guān)性
　　 在117例原發(fā)性乳腺癌患者中106例(90.6

12、％)表達(dá)B7-H3。B7-H3主要表達(dá)于胞漿，胞膜或二者同時表達(dá)，而在間質(zhì)及癌旁正常乳腺組織中不表達(dá)。B7-H3的陽性表達(dá)率與年齡、組織學(xué)類型、腫瘤大小、分化程度及受體表達(dá)情況均無關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期明顯相關(guān)（p值分別為0.018和0.011）。
　　 3.乳腺癌細(xì)胞中ILT4與B7-H3表達(dá)的相關(guān)性
　　 ILT4和B7-H3均在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，本研究通過Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)二者之間存在明顯正相關(guān)(

13、R=0.41;p＜0.01)。
　　 4.乳腺癌細(xì)胞中ILT4及B7-H3的表達(dá)與IL-10表達(dá)的相關(guān)性
　　 IL-10主要表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞胞漿中，為彌漫性、棕黃色顆粒。形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)IL-10也可表達(dá)在腫瘤間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞上。IL-10在乳腺癌細(xì)胞中的陽性表達(dá)率為80.34％(94/117)。其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(guān)，而與年齡、組織學(xué)類型、腫瘤大小、分化程度及受體表達(dá)情況均無明顯的相關(guān)性。ILT4及B7-H3的

14、表達(dá)與IL-10的表達(dá)之間存在明顯的正相關(guān)（R分別為:0.577和0.545，p值均＜0.01）。
　　 5.乳腺癌細(xì)胞中ILT4及B7-H3的表達(dá)與腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TILs)的相關(guān)性
　　 ILT4陽性表達(dá)組中TILs的數(shù)量為26.71±11.85，明顯低于ILT4陰性表達(dá)組:33.58±13.73，p=0.004。B7-H3陽性表達(dá)組中TILs的數(shù)量為27.41±11.17，而陰性表達(dá)組中的數(shù)量為33.71±12

15、.57，同樣有顯著性差異，p=0.005。IL-10陽性表達(dá)組及陰性表達(dá)組中TILs的數(shù)量分別為:27.65±12.91和34.80±14.49，兩組之間存在顯著差異，p=0.018。
　　 6.ILT4和B7-H3在乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)
　　 通過RT-PCR和WesternBlot發(fā)現(xiàn)，ILT4和B7-H3mRNA及蛋白在MDA-MB-453、MDA-MB-231、MCF-7和SK-BR-3等4株乳腺癌細(xì)胞株中均有表

16、達(dá)。本研究選用SK-BR-3細(xì)胞株作為后續(xù)過表達(dá)ILT4的實驗細(xì)胞株，而MDA-MB-231細(xì)胞株作為后續(xù)shRNA干擾的實驗細(xì)胞株。
　　 7.pEZ-ILT4質(zhì)粒鑒定
　　 通過Spe(I)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切方法和測序鑒定pEZ-ILT4質(zhì)粒，結(jié)果顯示目的片段完全符合。
　　 8.pGPU6-shILT4質(zhì)粒的篩選
　　 4組pGPU6-shILT4質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞株，48小時

17、后，RT-PCR和WesternBlot分別檢測其ILT4表達(dá)水平。與對照組相比，4個干擾組ILT4的mRNA及蛋白水平表達(dá)均明顯下調(diào)，p值均小于0.01;尤以pGPU6-shILT4-853組下調(diào)明顯，p＜0.001。將pGPU6-shILT4-853定義為pGPU6-shILT用于后續(xù)實驗。
　　 9.pEZ-ILT4瞬時轉(zhuǎn)染SK-BR-3細(xì)胞株后上調(diào)B7-H3mRNA和蛋白的表達(dá)
　　 ILT4過表達(dá)組中B7-H3

18、的mRNA相對表達(dá)量(146.7±15.28)％明顯高于對照組(74.2±4.01)％，p=0.001。ILT4過表達(dá)組及對照組中B7-H3蛋白的相對表達(dá)量分別為(136.4±10.1)％和(70.9±4.95)％，兩者之間存在明顯差異，p=0.001。
　　 10.pGPU6-shILT4瞬時轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞株后下調(diào)B7-H3mRNA和蛋白的表達(dá)
　　 ILT4干擾組中B7-H3的mRNA的相對表達(dá)量(54

19、.3±3.9)％明顯低于對照組(78.2±6.1)％，p=0.005。ILT4干擾組及對照組中B7-H3蛋白的相對表達(dá)量分別為(34.1±4.2)％，(62±4.6)％，兩者之間存在明顯差異，p=0.008。
　　 結(jié)論：
　　 1.ILT4分子高表達(dá)于腫瘤組織和轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織，而不表達(dá)于正常乳腺組織，且原發(fā)腫瘤組織中ILT4的表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示ILT4可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。乳腺癌組織中ILT4與I

20、L-10的表達(dá)明顯正相關(guān)，與TILs數(shù)量明顯負(fù)相關(guān)，表明在乳腺癌中ILT4和/或IL-10的表達(dá)抑制了TILs的活化和增殖，促進(jìn)了TILs的凋亡，改變了腫瘤微環(huán)境，逃避免疫攻擊，促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 2.乳腺癌組織中B7-H3和IL-10的表達(dá)明顯正相關(guān)，且與TILs數(shù)量負(fù)相關(guān)，表明B7-H3和/或IL-10的表達(dá)可能是通過抑制T細(xì)胞活化，逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。
　　 3.乳腺癌組織中癌細(xì)

21、胞上ILT4與B7-H3的表達(dá)呈正相關(guān)，且體外研究表明，
　　 在乳腺癌細(xì)胞株過表達(dá)ILT4可使B7-H3的表達(dá)增高，干擾ILT4表達(dá)后，B7-H3的表達(dá)明顯下降，表明ILT4在體外可通過某個信號途徑直接調(diào)節(jié)B7-H3的表達(dá)，誘導(dǎo)免疫耐受，逃避免疫攻擊，從而促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展。
　　 創(chuàng)新性及意義：
　　 1.本研究首次檢測了乳腺癌患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ILT4的表達(dá)情況，并分析了乳腺癌組織中ILT4的表達(dá)與臨床病理因素的

22、相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組ILT4的陽性表達(dá)率明顯高于無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，表明ILT4可能參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，從而為以ILT4為靶點的靶向治療和防治策略提供了理論依據(jù)。
　　 2.本研究首次分析了乳腺癌組織中ILT4和B7-H3的表達(dá)與IL-10表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)ILT4和B7-H3的表達(dá)與IL-10的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，為更進(jìn)一步探討ILT4和B7-H3在腫瘤免疫逃逸中的機(jī)制拓展新思路。
　　 3.本研究首次通