深Ⅱ度燒傷皮膚細胞外基質降解產物的自噬誘導活性及其可再生利用的初步研究.pdf

1、背景：深度燒傷創(chuàng)面的治療，特別是對于功能部位的治療，一直是燒傷外科領域研究的重點和難點。臨床顯示，大面積深度燒傷患者自體皮源缺乏而導致創(chuàng)面閉合困難，而應用無細胞真皮替代物與自體刃厚皮或培養(yǎng)表皮片復合移植治療大面積深度燒傷創(chuàng)面不僅解決了創(chuàng)面封閉困難問題，而且還能夠明顯減輕超薄皮片瘢痕增生和攣縮畸形的產生。然而異源性支架材料存在免疫原性且價格昂貴，難以滿足燒傷患者大面積植皮的需要。近年研究顯示，保留燒傷變性真皮，同時移植自體刃厚或薄中厚皮片

2、治療深度燒傷創(chuàng)面，術后移植區(qū)功能及外形恢復良好，提示燒傷變性皮膚能可逆性恢復部分真皮功能和形態(tài)的特點。大面積深Ⅱ度燒傷患者切痂術后丟棄的變性真皮是否可再利用成為本課題研究的重點。
　　近年，自噬是生命科學最熱的研究領域，自噬是真核細胞特有的普遍生命現(xiàn)象，在維持細胞自我穩(wěn)態(tài)、促進細胞生存方面起重要作用，廣泛參與多種生理和病理過程。研究顯示，溶酶體酶可轉移至胞質內側甚至分泌到細胞外降解ECM，同時細胞發(fā)生自噬的機制也與溶酶體酶大量釋放

3、有關[1]，推測ECM降解產物與細胞自噬存在某種關聯(lián)，具有細胞自噬誘導活性。
　　因此，本研究旨在探討深Ⅱ度燒傷皮膚(DBS)中的ECM降解產物是否具有自噬誘導活性、深Ⅱ度燒傷真皮基質(DBDM)的制備方法、組織相容性以及作為真皮替代物修復深度燒傷創(chuàng)面的可行性。
　　目的：(1)觀察自噬相關基因Beclin1在大鼠深Ⅱ度燒傷皮膚(DBS)中的表達，初步探討自噬與燒傷皮膚之間的關系。(2)探討DBDM是否具有自噬誘導活性;并探

4、討利用DBS作為真皮替代物構建復合皮移植模型進行修復創(chuàng)面的可行性。
　　方法：(1)16只雄性Wistar大鼠隨機分為正常組（對照組）和燙傷組（實驗組），每組各8只。實驗組建立DBS模型，燙傷后分別于1、3、7d取材。組織學檢查觀察各組動物皮膚全層情況，免疫組化檢測Beclin1在各組動物皮膚的表達，并行圖像處理和統(tǒng)計學分析。(2)真皮支架制作:采用酶消化法[2]，實驗組取2只大鼠燙傷24h后皮膚進行脫細胞等處理，制備DBDM;對

5、照組采用Wistar大鼠正常皮膚制備ADM。①埋植實驗:20只雄性Wistar大鼠隨機分為深Ⅱ度燒傷真皮基質(DBDM)埋植組（實驗組）和無細胞真皮基質(ADM)埋植組（對照組），每組10只。各組分別于3d、1w、2w、3w時取材，組織學檢查觀察真皮支架內細胞生長情況，免疫組化檢測各組各時間點Beclin1在真皮支架的表達水平，并行圖像處理和統(tǒng)計學分析。②復合皮移植實驗:20只雄性Wistar大鼠隨機分為深Ⅱ度燒傷真皮基質(DBDM)移

6、植組（實驗組）和無細胞真皮基質(ADM)移植組（對照組），每組10只。取新生24h內大鼠乳鼠背部完整皮膚，修薄后與網(wǎng)狀DBDM（實驗組）一次性重疊移植到大鼠背部約2cm×2cm全層皮膚缺損創(chuàng)面，14d后觀察復合皮生長情況。對照組ADM與薄的大鼠乳鼠表皮片重疊進行復合移植，實驗方法同實驗組。
　　結果：(1)Beclin1蛋白在實驗組表達陽性，對照組表達陰性，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(2)新鮮制備的DBDM呈淺黃白

7、色，質地較柔軟，有一定的韌性和伸展性，較ADM弱。鏡下膠原纖維增粗和透明樣變，排列紊亂、疏松，無細胞、血管和毛囊等成分存在。①埋植實驗:術后各組大鼠創(chuàng)口周圍皮膚無明顯腫脹及炎性反應，切口愈合良好，移植物與創(chuàng)面組織愈著緊密。組織學觀察，DBDM及ADM植入3d時，可見成纖維細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等浸潤。植入1w時，各支架內可見大量成纖維細胞侵入、增生，并沿膠原纖維方向分布，新生毛細血管向移植物內部延伸。植入2w、3w時，移植物內血管數(shù)

8、量進一步增多，并在移植物內廣泛分布。免疫組織化學染色顯示，實驗組Beclin1蛋白的表達量于1w時達到高峰，實驗組和對照組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。②復合皮移植實驗:術后14d，兩組大鼠及移植物的成活率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，雙層復合皮與皮下組織緊密連接，深層DBDM或ADM呈粉紅色，未見明顯腫脹及炎性反應。與ADM相比，DBDM組移植物較早出現(xiàn)炎性細胞浸潤和成纖維細胞、毛細血管長入;炎性細胞以中性粒細胞和巨噬細胞為主

9、，新生膠原蛋白沉積較快，纖維排列規(guī)則、致密。
　　結論：(1)Beclin1蛋白在Wistar大鼠燙傷皮膚中的表達呈陽性，推測自噬參與深Ⅱ度燙傷皮膚的修復過程。(2)DBDM來源廣泛、制備方法簡單，移植物生物相容性好，無皮膚燒傷毒素樣反應，具有增強自噬誘導活性，誘導細胞自噬清除受損細胞器，使細胞免于受到進一步損傷及發(fā)生凋亡，為轉入修復階段創(chuàng)造條件，具有恢復正常結構的潛力，可充當自體刃厚皮片的真皮替代物。本研究可為今后臨床改造和利用