功勞木提取物DMAG逆轉(zhuǎn)人白血病K562-ADM細(xì)胞多藥耐藥的研究.pdf

1、目的：從中藥功勞木提取物中篩選出具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性的單體成分，研究其逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用，并探討其逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用機(jī)制。
　　 方法：通過(guò)高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)功勞木提取物對(duì)人白血病K562/ADM細(xì)胞內(nèi)羅丹明123(rhodamine123，Rh123)蓄積的影響，篩選具有抑制K562/ADM細(xì)胞膜上P-gp功能的活性成分；MTT法檢測(cè)功勞木活性成分對(duì)K562及K562/ADM細(xì)胞的無(wú)毒劑量以及對(duì)阿霉素(adria

2、mycin，ADM)的耐藥逆轉(zhuǎn)作用；高內(nèi)涵系統(tǒng)檢測(cè)功勞木活性成分對(duì)ADM在K562/ADM細(xì)胞內(nèi)蓄積的影響；Rh123蓄積實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)活性成分對(duì)P—糖蛋白(P—glycoprotein，P—gP)功能的影響； PI/Hoechst33342雙染法檢測(cè)功勞木活性成分對(duì)ADM誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響；半定量RT—PCR法檢測(cè)功勞木活性成分對(duì)K562/ADM細(xì)胞MDR1耐藥基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1．從功勞木提取

3、物中篩選出6種具有抑制K562/ADM細(xì)胞膜上P—gp功能的活性成分，其中活性最強(qiáng)的為DMAG，本論文即研究該化合物對(duì)K562/ADM細(xì)胞的MDR的逆轉(zhuǎn)作用。
　　 2．MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，0．1μmol/L為DMAG的無(wú)毒劑量，其對(duì)K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞的抑制率均<10％。在無(wú)毒劑量及其以下設(shè)置5個(gè)濃度(0．01μmol/L、0．02μmol/L、0．04μmol/L、0．08μmol/L、0．1μmol/L)分別

4、與ADM聯(lián)用，可濃度依賴(lài)性地逆轉(zhuǎn)K562/ADM細(xì)胞的耐藥性(逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為3．17、3．99、5．01、6．14、6．45)，其逆轉(zhuǎn)作用明顯強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照維拉帕米(Verapamil)。
　　 3．ADM蓄積實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)明顯減少，而經(jīng)DMAG處理后逐漸恢復(fù)到接近敏感株細(xì)胞的水平，表明DMAG能直接抑制P—gp的功能，恢復(fù)ADM在細(xì)胞內(nèi)的正常分布而達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的目的。
　　 4．Rh123蓄積實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

5、結(jié)果顯示無(wú)毒劑量的DMAG可劑量相關(guān)性增加耐藥細(xì)胞株K562/ADM細(xì)胞內(nèi)Rh123的蓄積，對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)。Rh123的蓄積沒(méi)有影響。
　　 5．無(wú)毒劑量的DMAG單獨(dú)使用時(shí)對(duì)K562和K562/ADM細(xì)胞凋亡沒(méi)有影響，與ADM聯(lián)用后均可增強(qiáng)ADM誘導(dǎo)的K562/ADM細(xì)胞凋亡，作用明顯強(qiáng)于單用ADM引起的細(xì)胞凋亡，與ADM聯(lián)用后對(duì)K562細(xì)胞的凋亡同只用ADM引起的細(xì)胞凋亡相當(dāng)。
　　 6．半定量RT—PCR法檢測(cè)結(jié)

6、果顯示DMAG作用前后K562/ADM細(xì)胞內(nèi)MDR1基因表達(dá)水平有下調(diào)趨勢(shì)，且隨濃度增加下調(diào)趨勢(shì)逐漸明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1．功勞木提取物DMAG具有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)人白血病K562/ADM細(xì)胞多藥耐藥活性。
　　 2．DMAG通過(guò)下調(diào)MDR1基因及其蛋白產(chǎn)物P—gp的表達(dá)水平、抑制K562/ADM細(xì)胞膜上P—gp的外排功能，恢復(fù)P—gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥細(xì)胞株對(duì)藥物的敏感性，增加細(xì)胞內(nèi)ADM濃度，提高ADM對(duì)耐