小鼠胎盤造血功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、血細(xì)胞的發(fā)生指的是由造血組織中的干細(xì)胞經(jīng)增殖、分化直至成熟而形成各種血細(xì)胞的過(guò)程。所謂造血干細(xì)胞，是指存在于造血組織內(nèi)的一類能分化發(fā)育成各種血細(xì)胞的原始細(xì)胞?，F(xiàn)在一般認(rèn)為，在造血組織中存在一類能生成各種血細(xì)胞的最原始的細(xì)胞，稱之為全能造血干細(xì)胞。THSC在一定的造血微環(huán)境和某些因素的誘導(dǎo)下可增殖分化為多能淋巴干細(xì)胞和多能髓性造血干細(xì)胞。前者可進(jìn)一步分化、發(fā)育成功能性的淋巴細(xì)胞，后者可發(fā)育成粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞系、紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系等造血祖細(xì)

2、胞，并進(jìn)一步發(fā)育為白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板等。因而，從造血細(xì)胞發(fā)生的角度可把造血細(xì)胞簡(jiǎn)要分為三大部分，即造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞和可辨認(rèn)的前體細(xì)胞。造血的過(guò)程就是造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞增殖分化形成血細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，但不包括成熟細(xì)胞在體內(nèi)的儲(chǔ)存、釋放以及分配的過(guò)程。造血活動(dòng)以造血干細(xì)胞及造血祖細(xì)胞的活動(dòng)為主。 在胚胎造血系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中，首先由中胚層的間充質(zhì)組織分化為血液成血管細(xì)胞，進(jìn)而形成HSC和成血管細(xì)胞。HSC首先發(fā)生的部位見于

3、胚外卵黃囊血島和胚內(nèi)主動(dòng)脈旁臟壁層/主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)。隨著胚體內(nèi)外血循環(huán)的建立，HSC被播散在肝臟和脾臟，最終主要定居在骨髓，維持機(jī)體終身造血。 胚胎造血發(fā)育的研究迄今已有百余年歷史，在哺乳動(dòng)物的胚胎中，卵黃囊，肝臟，胸腺，脾臟和骨髓都已經(jīng)被看作是具有造血功能的器官。近年來(lái)，有些研究認(rèn)為，胎盤也是一個(gè)造血器官，在胚胎期發(fā)揮著重要作用。但是目前就胎盤是否具有造血功能仍有激烈爭(zhēng)論。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用多種實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)了胎盤的造血功能，力

4、圖進(jìn)一步明確胎盤是否存在造血功能和胎盤造血的生物學(xué)特點(diǎn)。 第一部分小鼠胎盤組織中單個(gè)核細(xì)胞的分離、鑒定和胎盤中固有造血干/祖細(xì)胞(HS/PCs)的確認(rèn) 研究目的：從小鼠胎盤中去除胎盤中所含有的胎兒血和母體血，分離和檢測(cè)胎盤組織中固有的HS/PCs，探討小鼠胎盤是否具有造血功能。 研究方法： 1、取孕12.5天小鼠，0.2ml水合氯醛腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下取出孕子宮，剝離子宮，完整取出胎鼠及其胎盤。在體視

5、鏡下觀察，通過(guò)血流方向辨別臍動(dòng)脈和臍靜脈。將注射器(BD29G)針頭朝向胎盤方向插入臍動(dòng)脈，緩慢的將沖洗液肝素生理鹽水(0.5mg/ml，290000IU/ml)注入臍動(dòng)脈。邊注射邊觀察，直至臍靜脈中無(wú)血細(xì)胞回流，臍靜脈中的液體變澄清，于是拔出注射器，終止注射。將沖出的胎盤內(nèi)的胎兒血細(xì)胞收集，作為對(duì)照。然后將胎盤從母體蛻膜、臍血管及卵黃囊殘跡上剝離，徹底沖洗胎盤中的母體血，直至胎盤變成白色。 2、將沖洗后的胎盤作石蠟切片，蘇木素

6、伊紅染色，觀察胎盤組織中是否殘留血細(xì)胞。 3、將沖洗后的胎盤充分剪碎，加入0.1％膠原酶IV在37℃下攪拌消化30min，終止消化，離心。然后再加入0.25％胰酶37℃孵育10min，終止消化，離心。加入1ml新鮮培養(yǎng)基(IMDM)，做成細(xì)胞懸液，以備通過(guò)離心提取單個(gè)核細(xì)胞。 4、將三種密度的Percoll梯度液(1.10g/ml，1.080g/ml，1.055g/ml)用長(zhǎng)針頭注射器按密度從高到低逐層輕輕放置到10ml

7、離心管中。將細(xì)胞懸液輕輕置于最上層，以2000rpm離心25min。用吸管將上層和中間層分離液之間的細(xì)胞帶小心取出，再加入1ml新鮮培養(yǎng)液IMDM，制成單個(gè)核細(xì)胞懸液。 5、制作細(xì)胞涂片，Giemsa染色。光學(xué)顯微鏡觀察是否為單個(gè)核細(xì)胞。 6、運(yùn)用脾結(jié)節(jié)形成技術(shù)檢測(cè)從胎盤組織中提取的單個(gè)核細(xì)胞是否為造血干細(xì)胞。 結(jié)果： 1、沖洗后胎盤胎兒血管內(nèi)均見不到胎兒血細(xì)胞，胎盤中的胎兒血已經(jīng)被清除干凈。 2

8、、采用組合酶消化法制備胎盤細(xì)胞懸液，Percoll密度梯度離心法分離的細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞涂片Giemsa染色光鏡觀察，確認(rèn)為單個(gè)核細(xì)胞，直徑在7～10μm，形似小淋巴細(xì)胞。 3、將分離后得到的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸入致死劑量照射的小鼠，觀察到受體鼠脾臟上出現(xiàn)大量脾結(jié)節(jié)。脾臟組織切片蘇木素伊紅染色光鏡觀察確認(rèn)為脾結(jié)節(jié)形成單位，即造血集落。 結(jié)論： 采用胎盤沖洗的方法可以將胎盤中的胎兒血細(xì)胞和母體血細(xì)胞清除干凈，Percol

9、l密度梯度離心法可有效分離胎盤中單個(gè)核細(xì)胞。脾結(jié)節(jié)實(shí)驗(yàn)顯示，這些單個(gè)核細(xì)胞具有形成脾結(jié)節(jié)的能力，符合HS/PCs的特征，是胎盤中固有的HS/PCs。 第二部分運(yùn)用HS/PCs的表面標(biāo)志確認(rèn)胎盤固有HS/PCs的存在及其數(shù)量和分布 研究目的：運(yùn)用免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胎盤組織中單個(gè)核細(xì)胞的表面標(biāo)志，以確認(rèn)胎盤固有HS/PCs的存在及其數(shù)量和分布，從而進(jìn)一步證明胎盤的造血功能。 研究方法： 1、運(yùn)用免疫

10、熒光技術(shù)檢測(cè)胎盤組織中的單個(gè)核細(xì)胞是否表達(dá)HS/PCs特異性抗原CD34、CD117和Sca-1，以便進(jìn)一步確認(rèn)胎盤組織中存在固有的HS/PCs。 2、運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)來(lái)自胎盤組織中的CD34、CD117和Sca-1陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)數(shù)和絕對(duì)數(shù)，以判斷胎盤固有造血細(xì)胞的分化狀況，并與來(lái)自胎盤胎兒血中的單個(gè)核細(xì)胞的相應(yīng)檢測(cè)結(jié)果比對(duì)。 3、胎盤冰凍切片，CD34、CD117和Sca-1免疫組化染色，以觀察胎盤固有HS/PCs在

11、胎盤組織中的分布狀況。 結(jié)果： 1、免疫熒光染色顯示胎盤組織中的單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)HS/PCs特異性抗原CD34，CD117和Sca-1。CD34+細(xì)胞百分率為20.1±5.3％，CD117+細(xì)胞百分率為28.5±3.4％，Sca-1+細(xì)胞百分率為35±8.6％。證明胎盤中的這些單個(gè)核細(xì)胞確實(shí)為HS/PCs。 2、流式細(xì)胞術(shù)顯示，胎盤HS/PCs表達(dá)HS/PCs特異性抗原CD34，CD117和Sca-1的三個(gè)細(xì)胞群所

12、占的比例分別為20.2％，24.6％和26.2％。在來(lái)自胎盤胎兒血的單個(gè)核細(xì)胞中，這三個(gè)細(xì)胞群所占的比例分別為8.2％，6.3％和6.5％。胎盤的單個(gè)核細(xì)胞中三種陽(yáng)性細(xì)胞的濃度均高于胎盤胎兒血的單個(gè)核細(xì)胞。胎盤的單個(gè)核細(xì)胞中，CD34+、CD117+、Sca-1+陽(yáng)性細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)分別為1.4×104，1.8×104和1.8×104，在胎盤胎兒血單個(gè)核細(xì)胞中則分別為0.7×104，0.5×104和0.5×104。胎盤的單個(gè)核細(xì)胞中三種陽(yáng)性

13、細(xì)胞數(shù)均高于胎盤胎兒血。胎盤的單個(gè)核細(xì)胞中CD34+/Sca-1+細(xì)胞所占的比例為15.3％，要比胎盤胎兒血中的比例高，后者為5.1％。 3、在E12.5的鼠胚胎盤中，胎盤迷路內(nèi)可見CD34+細(xì)胞、CD117+細(xì)胞和Sca-1+細(xì)胞，在絨毛膜板也可見CD117+細(xì)胞，Sca-1表達(dá)量顯著高于CD34和CD117。 結(jié)論： 運(yùn)用HS/PCs表面特異性抗原的免疫組化、免疫熒光染色和流式細(xì)胞技術(shù)，進(jìn)一步證明了胎盤具有造

14、血功能，胎盤組織中存在固有的HS/PCs，且具有一定的分布規(guī)律。 第三部分胎盤單個(gè)核細(xì)胞的體外培養(yǎng)和造血調(diào)控基因表達(dá)的檢測(cè)確認(rèn)胎盤的造血功能 研究目的：通過(guò)對(duì)胎盤組織中單個(gè)核細(xì)胞的體外培養(yǎng)、造血集落形成和造血調(diào)控基因表達(dá)的觀察和檢測(cè)，進(jìn)一步證明胎盤的造血功能。 研究方法： 1、將胎盤單個(gè)核細(xì)胞接種在甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)14d后觀察是否形成造血集落，并確定集落的屬性，檢測(cè)高增殖潛能集落形

15、成狀況。取自胎盤胎兒血液的單個(gè)核細(xì)胞作上述同樣檢測(cè)，作為陽(yáng)性對(duì)比。 2、RT-PCR檢測(cè)胎盤組織中單個(gè)核細(xì)胞Scl、Runxl、Tel/Etv6、GATA-2的表達(dá)狀況。 結(jié)果： 1、胎盤單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)14天后，可見BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM的集落形成。胎盤胎兒血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)14天后，也可見BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM的集落生成，但前者的BFU-E、CHU-GM和CFU-GEMM集

16、落數(shù)均高于后者，前者BFU-E的形態(tài)特點(diǎn)為多中心，高度血紅蛋白化；后者BFU-E則為弱血紅蛋白化。前者CFU-GM集落較致密，大小為中度或較大，有時(shí)集落巨大，好像是幾個(gè)集落融合而成；后者CFU-GM集落則較小。兩者的CFU-GEMM集落都很大，都可以用作為HPP-CFCs的來(lái)源。 2、來(lái)自胎盤組織和來(lái)自胎盤胎兒血細(xì)胞的HPP-CFCs培養(yǎng)60天后，均形成直徑超過(guò)0.5mm的集落。105個(gè)胎盤單個(gè)核細(xì)胞再植后可獲得35個(gè)CFU-G

17、EMM集落，胎盤胎兒血單個(gè)核細(xì)胞再植后也可以獲得CFU-GEMM集落，但數(shù)量?jī)H為胎盤細(xì)胞的2/3，而且胎盤胎兒血單個(gè)核細(xì)胞形成的集落要比胎盤單個(gè)核細(xì)胞形成的集落小。 3、造血調(diào)控相關(guān)基因Scl、Runxl、Tel/Etv6、GATA-2在胎盤組織的單個(gè)核細(xì)胞上均有表達(dá)。 結(jié)論： 胎盤組織中的單個(gè)核細(xì)胞在體外培養(yǎng)中可形成多種造血祖細(xì)胞克隆，并可檢測(cè)到HPP-CFCs(體外培養(yǎng)的最原始的多潛能造血前體細(xì)胞之一)的活性