小鼠胎盤造血功能的實驗研究.pdf

1、血細胞的發(fā)生指的是由造血組織中的干細胞經增殖、分化直至成熟而形成各種血細胞的過程。所謂造血干細胞，是指存在于造血組織內的一類能分化發(fā)育成各種血細胞的原始細胞?，F在一般認為，在造血組織中存在一類能生成各種血細胞的最原始的細胞，稱之為全能造血干細胞。THSC在一定的造血微環(huán)境和某些因素的誘導下可增殖分化為多能淋巴干細胞和多能髓性造血干細胞。前者可進一步分化、發(fā)育成功能性的淋巴細胞，后者可發(fā)育成粒細胞巨噬細胞系、紅細胞系、巨核細胞系等造血祖細

2、胞，并進一步發(fā)育為白細胞、紅細胞和血小板等。因而，從造血細胞發(fā)生的角度可把造血細胞簡要分為三大部分，即造血干細胞、造血祖細胞和可辨認的前體細胞。造血的過程就是造血干細胞、祖細胞增殖分化形成血細胞的動態(tài)平衡過程，但不包括成熟細胞在體內的儲存、釋放以及分配的過程。造血活動以造血干細胞及造血祖細胞的活動為主。 在胚胎造血系統的發(fā)育過程中，首先由中胚層的間充質組織分化為血液成血管細胞，進而形成HSC和成血管細胞。HSC首先發(fā)生的部位見于

3、胚外卵黃囊血島和胚內主動脈旁臟壁層/主動脈-性腺-中腎區(qū)。隨著胚體內外血循環(huán)的建立，HSC被播散在肝臟和脾臟，最終主要定居在骨髓，維持機體終身造血。 胚胎造血發(fā)育的研究迄今已有百余年歷史，在哺乳動物的胚胎中，卵黃囊，肝臟，胸腺，脾臟和骨髓都已經被看作是具有造血功能的器官。近年來，有些研究認為，胎盤也是一個造血器官，在胚胎期發(fā)揮著重要作用。但是目前就胎盤是否具有造血功能仍有激烈爭論。本實驗應用多種實驗方法，檢測了胎盤的造血功能，力

4、圖進一步明確胎盤是否存在造血功能和胎盤造血的生物學特點。 第一部分小鼠胎盤組織中單個核細胞的分離、鑒定和胎盤中固有造血干/祖細胞(HS/PCs)的確認 研究目的：從小鼠胎盤中去除胎盤中所含有的胎兒血和母體血，分離和檢測胎盤組織中固有的HS/PCs，探討小鼠胎盤是否具有造血功能。 研究方法： 1、取孕12.5天小鼠，0.2ml水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌條件下取出孕子宮，剝離子宮，完整取出胎鼠及其胎盤。在體視

5、鏡下觀察，通過血流方向辨別臍動脈和臍靜脈。將注射器(BD29G)針頭朝向胎盤方向插入臍動脈，緩慢的將沖洗液肝素生理鹽水(0.5mg/ml，290000IU/ml)注入臍動脈。邊注射邊觀察，直至臍靜脈中無血細胞回流，臍靜脈中的液體變澄清，于是拔出注射器，終止注射。將沖出的胎盤內的胎兒血細胞收集，作為對照。然后將胎盤從母體蛻膜、臍血管及卵黃囊殘跡上剝離，徹底沖洗胎盤中的母體血，直至胎盤變成白色。 2、將沖洗后的胎盤作石蠟切片，蘇木素

6、伊紅染色，觀察胎盤組織中是否殘留血細胞。 3、將沖洗后的胎盤充分剪碎，加入0.1％膠原酶IV在37℃下攪拌消化30min，終止消化，離心。然后再加入0.25％胰酶37℃孵育10min，終止消化，離心。加入1ml新鮮培養(yǎng)基(IMDM)，做成細胞懸液，以備通過離心提取單個核細胞。 4、將三種密度的Percoll梯度液(1.10g/ml，1.080g/ml，1.055g/ml)用長針頭注射器按密度從高到低逐層輕輕放置到10ml

7、離心管中。將細胞懸液輕輕置于最上層，以2000rpm離心25min。用吸管將上層和中間層分離液之間的細胞帶小心取出，再加入1ml新鮮培養(yǎng)液IMDM，制成單個核細胞懸液。 5、制作細胞涂片，Giemsa染色。光學顯微鏡觀察是否為單個核細胞。 6、運用脾結節(jié)形成技術檢測從胎盤組織中提取的單個核細胞是否為造血干細胞。 結果： 1、沖洗后胎盤胎兒血管內均見不到胎兒血細胞，胎盤中的胎兒血已經被清除干凈。 2

8、、采用組合酶消化法制備胎盤細胞懸液，Percoll密度梯度離心法分離的細胞，經細胞涂片Giemsa染色光鏡觀察，確認為單個核細胞，直徑在7～10μm，形似小淋巴細胞。 3、將分離后得到的單個核細胞經尾靜脈輸入致死劑量照射的小鼠，觀察到受體鼠脾臟上出現大量脾結節(jié)。脾臟組織切片蘇木素伊紅染色光鏡觀察確認為脾結節(jié)形成單位，即造血集落。 結論： 采用胎盤沖洗的方法可以將胎盤中的胎兒血細胞和母體血細胞清除干凈，Percol

9、l密度梯度離心法可有效分離胎盤中單個核細胞。脾結節(jié)實驗顯示，這些單個核細胞具有形成脾結節(jié)的能力，符合HS/PCs的特征，是胎盤中固有的HS/PCs。 第二部分運用HS/PCs的表面標志確認胎盤固有HS/PCs的存在及其數量和分布 研究目的：運用免疫熒光技術和流式細胞術檢測胎盤組織中單個核細胞的表面標志，以確認胎盤固有HS/PCs的存在及其數量和分布，從而進一步證明胎盤的造血功能。 研究方法： 1、運用免疫

10、熒光技術檢測胎盤組織中的單個核細胞是否表達HS/PCs特異性抗原CD34、CD117和Sca-1，以便進一步確認胎盤組織中存在固有的HS/PCs。 2、運用流式細胞術檢測來自胎盤組織中的CD34、CD117和Sca-1陽性細胞的相對數和絕對數，以判斷胎盤固有造血細胞的分化狀況，并與來自胎盤胎兒血中的單個核細胞的相應檢測結果比對。 3、胎盤冰凍切片，CD34、CD117和Sca-1免疫組化染色，以觀察胎盤固有HS/PCs在

11、胎盤組織中的分布狀況。 結果： 1、免疫熒光染色顯示胎盤組織中的單個核細胞表達HS/PCs特異性抗原CD34，CD117和Sca-1。CD34+細胞百分率為20.1±5.3％，CD117+細胞百分率為28.5±3.4％，Sca-1+細胞百分率為35±8.6％。證明胎盤中的這些單個核細胞確實為HS/PCs。 2、流式細胞術顯示，胎盤HS/PCs表達HS/PCs特異性抗原CD34，CD117和Sca-1的三個細胞群所

12、占的比例分別為20.2％，24.6％和26.2％。在來自胎盤胎兒血的單個核細胞中，這三個細胞群所占的比例分別為8.2％，6.3％和6.5％。胎盤的單個核細胞中三種陽性細胞的濃度均高于胎盤胎兒血的單個核細胞。胎盤的單個核細胞中，CD34+、CD117+、Sca-1+陽性細胞的絕對數分別為1.4×104，1.8×104和1.8×104，在胎盤胎兒血單個核細胞中則分別為0.7×104，0.5×104和0.5×104。胎盤的單個核細胞中三種陽性

13、細胞數均高于胎盤胎兒血。胎盤的單個核細胞中CD34+/Sca-1+細胞所占的比例為15.3％，要比胎盤胎兒血中的比例高，后者為5.1％。 3、在E12.5的鼠胚胎盤中，胎盤迷路內可見CD34+細胞、CD117+細胞和Sca-1+細胞，在絨毛膜板也可見CD117+細胞，Sca-1表達量顯著高于CD34和CD117。 結論： 運用HS/PCs表面特異性抗原的免疫組化、免疫熒光染色和流式細胞技術，進一步證明了胎盤具有造

14、血功能，胎盤組織中存在固有的HS/PCs，且具有一定的分布規(guī)律。 第三部分胎盤單個核細胞的體外培養(yǎng)和造血調控基因表達的檢測確認胎盤的造血功能 研究目的：通過對胎盤組織中單個核細胞的體外培養(yǎng)、造血集落形成和造血調控基因表達的觀察和檢測，進一步證明胎盤的造血功能。 研究方法： 1、將胎盤單個核細胞接種在甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)14d后觀察是否形成造血集落，并確定集落的屬性，檢測高增殖潛能集落形

15、成狀況。取自胎盤胎兒血液的單個核細胞作上述同樣檢測，作為陽性對比。 2、RT-PCR檢測胎盤組織中單個核細胞Scl、Runxl、Tel/Etv6、GATA-2的表達狀況。 結果： 1、胎盤單個核細胞培養(yǎng)14天后，可見BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM的集落形成。胎盤胎兒血單個核細胞培養(yǎng)14天后，也可見BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM的集落生成，但前者的BFU-E、CHU-GM和CFU-GEMM集

16、落數均高于后者，前者BFU-E的形態(tài)特點為多中心，高度血紅蛋白化；后者BFU-E則為弱血紅蛋白化。前者CFU-GM集落較致密，大小為中度或較大，有時集落巨大，好像是幾個集落融合而成；后者CFU-GM集落則較小。兩者的CFU-GEMM集落都很大，都可以用作為HPP-CFCs的來源。 2、來自胎盤組織和來自胎盤胎兒血細胞的HPP-CFCs培養(yǎng)60天后，均形成直徑超過0.5mm的集落。105個胎盤單個核細胞再植后可獲得35個CFU-G

17、EMM集落，胎盤胎兒血單個核細胞再植后也可以獲得CFU-GEMM集落，但數量僅為胎盤細胞的2/3，而且胎盤胎兒血單個核細胞形成的集落要比胎盤單個核細胞形成的集落小。 3、造血調控相關基因Scl、Runxl、Tel/Etv6、GATA-2在胎盤組織的單個核細胞上均有表達。 結論： 胎盤組織中的單個核細胞在體外培養(yǎng)中可形成多種造血祖細胞克隆，并可檢測到HPP-CFCs(體外培養(yǎng)的最原始的多潛能造血前體細胞之一)的活性