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1、一氧化氮(NO)是一種重要的信號(hào)物質(zhì)。在動(dòng)物體中,NO已被證明與多種代謝途徑有關(guān):包括神經(jīng)傳遞、免疫以及血管平滑肌的松弛過程等。在植物體中,NO也被證明參與到呼吸作用、光形態(tài)建成、種子萌發(fā)、根葉的生長(zhǎng)發(fā)育、氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)、衰老等多種生理過程中。動(dòng)物主要通過L-精氨酸依賴的NOS途徑來合成體內(nèi)的NO。而關(guān)于植物體中NO合成途徑的研究目前還存在諸多爭(zhēng)議,但研究者們普遍接受在植物體中普遍存在兩種互不關(guān)聯(lián)的NO合成途徑:即硝酸/亞硝酸還原酶依賴
2、的NO合成途徑以及類似于動(dòng)物的以L-精氨酸為底物的一氧化氮合酶(NOS)依賴的NO合成途徑。2003年,Guo等報(bào)道了擬南芥中的一氧化氮合酶—AtNOS1。然而,后續(xù)的多項(xiàng)相關(guān)研究都表明AtNOS1并不具有NOS活性,它只是間接影響了擬南芥細(xì)胞內(nèi)部NO的含量。AtNOS1也由此被重新命名為AtNOA1,意為一氧化氮合成相關(guān)蛋白1。盡管NOA1并不具有NO合酶的活性,但NOA1的缺失突變體仍然因?yàn)榫哂休^低的NO水平而存在研究?jī)r(jià)值。本研究室
3、的前期研究發(fā)現(xiàn):OsNOA1的干涉植株在22℃條件下生長(zhǎng)時(shí)表現(xiàn)出黃化表型;而在30℃條件下生長(zhǎng)時(shí),干涉植株與野生型水稻卻無(wú)明顯表型差異?;谝陨蟽牲c(diǎn),本文以干涉植株(OsNOA1-RNAi)與超表達(dá)植株(OsNOA1-Ox)為材料研究了OsNOA1轉(zhuǎn)基因水稻低溫敏感表型的內(nèi)在機(jī)理及低溫敏感表型與轉(zhuǎn)基因植株中NO水平的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:
1.干涉與超表達(dá)OsNOA1轉(zhuǎn)基因水稻的比較分析
通過表型觀察、葉綠素與Ru
4、bisco含量測(cè)定等實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)OsNOA1超表達(dá)株系表現(xiàn)出與干涉植株相類似的低溫敏感黃化表型。并且在低溫條件下,超表達(dá)植株的葉綠素與Rubisco含量隨著OsNOA1表達(dá)量的提高而逐漸降低。葉綠素與Rubisco代謝途徑相關(guān)基因的定量RT-PCR分析結(jié)果表明:低溫處理?xiàng)l件下,干涉植株與OsNOA1上調(diào)較多的超表達(dá)株系(OsNOA1-Ox line22;OsNOA1-Ox line45)中葉綠素與蛋白的合成代謝都受到了不同程度的影響,
5、而在常溫條件下轉(zhuǎn)基因植株中這些代謝途徑受到的影響不明顯。通過溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)證明,OsNOA1對(duì)葉綠體蛋白的合成起到了調(diào)控作用。定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明,干涉植株與超表達(dá)植株中顯著差異蛋白的生物學(xué)過程極為相似,進(jìn)一步說明顯著下調(diào)或者上調(diào)OsNOA1對(duì)水稻蛋白合成機(jī)制所造成的影響是類似的。對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行的GO分析也表明OsNOA1與葉綠體蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)。
2.OsNOA1轉(zhuǎn)基因植株的低溫敏感表型與NO的關(guān)系
在
6、低溫條件下(22℃),向木村B培養(yǎng)基中添加外源NO供體SNP并不能挽救OsNOA1干涉植株的黃化表型,以Rubisco大小亞基為代表的葉綠體蛋白在SNP處理前后也無(wú)明顯變化。因此,OsNOA1轉(zhuǎn)基因植株的低溫敏感表型與NO含量之間并無(wú)直接聯(lián)系。
半定量RT-PCR鑒定到OsNOA1干涉植株中積累了大量的葉綠體16S rRNA前體,表明OsNOA1與葉綠體30S核糖體小亞基的功能相關(guān),葉綠體核糖體功能受損可能是造成OsNOA1轉(zhuǎn)
7、基因植株低溫敏感表型的直接原因。
3.OsNOA1互作蛋白的分辨
使用STRING蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了OsNOA1的互作蛋白。結(jié)果表明:核糖體蛋白很可能是OsNOA1的互作對(duì)象。本文利用多種方法篩查了OsNOA1的互作蛋白,并通過體外His-tag pull down實(shí)驗(yàn)成功篩選到了與OsNOA1互作的靶蛋白,其中包含葉綠體30S核糖體蛋白S2等多種葉綠體核糖體蛋白。上述結(jié)果表明OsNOA1的功能確實(shí)與葉綠體核糖體相
8、關(guān)。
4.葉綠體逆行信號(hào)在OsNOA1調(diào)控葉綠體蛋白合成過程中的作用
通過熒光HPLC測(cè)定了低溫下生長(zhǎng)的OsNOA1干涉植株與野生型水稻中鎂原卟啉IX(Mg-Proto IX)的含量。結(jié)果表明:干涉植株中的Mg-Proto IX大量積累。因此,OsNOA1有可能通過Mg-Proto IX介導(dǎo)的葉綠體逆行信號(hào)通路來調(diào)控細(xì)胞核編碼的葉綠體基因的表達(dá)。同時(shí),通過基于Cre-loxP重組體系的多基因干涉系統(tǒng),構(gòu)建并轉(zhuǎn)化了Os
9、NOA1與OsGUN1的雙基因干涉載體,獲得了OsNOA1與OsGUN1表達(dá)量同時(shí)下調(diào)的雙基因干涉水稻植株。但我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)OsGUN1的表達(dá)量并不能挽救OsNOA1表達(dá)量下調(diào)所導(dǎo)致的低溫敏感表型,意味著OsNOA1不是通過OsGUN1介導(dǎo)的逆行信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)核編碼的葉綠體基因的調(diào)控。
綜合上述結(jié)果,表明OsNOA1可能通過影響葉綠體核糖體的功能實(shí)現(xiàn)對(duì)葉綠體自編碼蛋白的直接調(diào)控,繼而通過鎂原卟啉IX介導(dǎo)的葉綠體逆行信號(hào)通路將信
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