裝載VEGF納米顆粒修飾去細(xì)胞血管基質(zhì)構(gòu)建及再生研究.pdf

1、第一章、裝載VEGF納米顆粒修飾去細(xì)胞血管基質(zhì)的構(gòu)建
　　 目的：探討肝素/殼聚糖為載體，VEGF為藥物的納米載藥顆粒制備工藝、工藝參數(shù)及顆粒性能。在此基礎(chǔ)上探討納米顆粒與去細(xì)胞牛頸靜脈的結(jié)合方式，評估其作為組織工程生物材料的可行性。
　　 方法：離子交聯(lián)法制備肝素/殼聚糖納米顆粒。根據(jù)制備條件分成Ⅰ-Ⅴ共5組(n=6)，調(diào)整殼聚糖分子量，殼聚糖溶液pH值，殼聚糖、肝素濃度及配比，選用不同分子量肝素制備納米顆粒，研究其結(jié)

2、構(gòu)和緩釋性能。
　　 采用物理自組裝和化學(xué)共價(jià)交聯(lián)將納米顆粒結(jié)合至牛頸靜脈。物理自組裝時(shí)間取2小時(shí)、4小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)；化學(xué)交聯(lián)劑EDC取0 mmol/L、5 mmol/L、10mmol/L、20mmol/L四種濃度。掃描電鏡和體外流體剪切力實(shí)驗(yàn)評價(jià)納米顆粒穩(wěn)定程度。將載納米顆粒牛頸靜脈浸入濃度為50ng、250ng/mL VEGF溶液中孵育過夜，ELISA定量分析VEGF緩釋性能。
　　 結(jié)果：離子交聯(lián)法制備肝

3、素/殼聚糖納米顆粒的最佳粒徑：67nm-92nm，PDI：0.08-0.121，Zata電位：+28mv～+30mv。物理自組裝及化學(xué)共價(jià)交聯(lián)使納米顆粒與牛頸靜脈牢固結(jié)合，VEGF在納米顆粒修飾牛頸靜脈表面載藥量可達(dá)197ng/mm2，30日VEGF累計(jì)緩釋量<42.17％。
　　 結(jié)論：離子交聯(lián)法成功構(gòu)建裝載VEGF肝素/殼聚糖納米顆粒。物理自組裝及化學(xué)交聯(lián)能夠?qū)崿F(xiàn)納米顆粒與去細(xì)胞血管基質(zhì)牢固結(jié)合。VEGF可在納米顆粒修飾去細(xì)

4、胞基質(zhì)表面大量載藥并長期緩釋。
　　 第二章、裝載VEGF納米顆粒修飾去細(xì)胞血管基質(zhì)體外及體內(nèi)再生研究
　　 目的：體外試驗(yàn)評價(jià)裝載VEGF納米顆粒修飾牛頸靜脈生物相容性及細(xì)胞粘附增殖能力。大鼠皮下包埋動(dòng)物模型評價(jià)裝載VEGF納米顆粒修飾牛頸靜脈體內(nèi)多種細(xì)胞浸潤和細(xì)胞外基質(zhì)再生動(dòng)態(tài)變化，并了解其變化機(jī)制。
　　 方法：體外性能研究：通過溶血率，血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)變化，APTT及血小板粘附評價(jià)去細(xì)胞光氧化牛頸靜脈及裝載

5、VEGF納米顆粒修飾牛頸靜脈體外生物相容性。采用細(xì)胞形態(tài)觀察法和MTT比色法評價(jià)各組內(nèi)皮細(xì)胞體外粘附及增殖能力。
　　 體內(nèi)性能研究：建立大鼠皮下包埋動(dòng)物模型，植入去細(xì)胞光氧化牛頸靜脈及裝載VEGF納米顆粒修飾牛頸靜脈血管片，分別于4周、8周取出標(biāo)本，大體形態(tài)觀察；組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞浸潤、微血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)主要成分再生情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、體外血液相容性試驗(yàn)：去細(xì)胞光氧化牛頸靜脈(S

6、F-DP)、裝載VEGF納米顆粒修飾牛頸靜脈(SF-NP-VEGF)、物理自組裝載VEGF納米顆粒修飾牛頸靜脈(SF-NP-VEGF NO EDC)各組溶血率分別為1.998％、1.277％、1.401％；血常規(guī)計(jì)數(shù)中SF-DP血小板數(shù)目低于其他組(P<0.05)。內(nèi)皮細(xì)胞種植試驗(yàn)結(jié)果：形態(tài)法觀察各組細(xì)胞毒性分級均為0-1級。SF-NP-50ng VEGF，SF-NP-250ng VEGF表面細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，具備血管發(fā)生傾向。MTT實(shí)驗(yàn)

7、顯示SF-NP-50ngVEGF，SF-NP-250ng VEGF表面細(xì)胞活力顯著強(qiáng)于SF-DP表面細(xì)胞活力(P<0.01)。
　　 2.體內(nèi)再生研究顯示：大鼠皮下包埋4周時(shí)，SF-DP少量細(xì)胞在外膜區(qū)域浸潤，無明顯微血管斷面及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生；SF-NP-250ng VEGF可見多種細(xì)胞浸潤，深度達(dá)血管壁1/4厚度，可見散在排布微血管斷面及均勻細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。大鼠皮下包埋8周時(shí)，SF-DP少量細(xì)胞浸潤，血管壁外側(cè)1/4可見微血管