選擇性頭部降溫對胎羊缺血性腦損傷紋狀體的保護作用.pdf

1、嚴重的圍產(chǎn)期窒息可引起基底神經(jīng)節(jié)的損傷和功能障礙，導(dǎo)致腦癱等后遺癥。亞低溫療法是近年來公認的最有可能用于新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)，尤其是中重度HIE的治療方法。紋狀體由不同表型的神經(jīng)細胞組成，可用各種神經(jīng)遞質(zhì)的酶、鈣結(jié)合蛋白和神經(jīng)肽進行標記。本課題用免疫組化染色方法，對胎羊的不同表型的紋狀體神經(jīng)元進行標記，以研究選擇性頭部降溫對胎羊缺血性腦損傷紋狀體神經(jīng)元的保護作用，

2、并通過研究亞低溫對缺血性腦損傷引起的凋亡和星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)的作用來探討亞低溫治療可能的作用機制。 第一部分選擇性頭部降溫對胎羊缺血性腦損傷紋狀體不同表型神經(jīng)元的保護作用。 目的:研究選擇性頭部降溫對缺血性腦損傷胎羊紋狀體不同表型神經(jīng)元的保護作用。 方法：胎羊于妊娠117-124天(足月為147天)時通過雙側(cè)頸動脈阻塞30min造成雙側(cè)腦缺血損傷，損傷后將胎羊隨機分為：損傷組(n=10)、2h低溫組(損傷后2h開始

3、亞低溫治療，n=7)和6h低溫組(損傷后6h開始亞低溫治療，n=8)，另設(shè)正常對照組(n=5)。通過冷循環(huán)水進行選擇性頭部降溫，維持硬膜外溫度為30-33℃，持續(xù)72h。實驗結(jié)束，通過剖宮產(chǎn)取出胎羊，固定腦組織。用免疫組化法檢測胎羊紋狀體膽堿乙酰基轉(zhuǎn)位酶(ChAT)，鈣結(jié)合蛋白(Calbindin-28kd)，神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)，神經(jīng)肽Y(NPY)和谷氨酸脫羧酶(GAD)免疫陽性細胞。 結(jié)果：1、亞低溫對膽堿能神經(jīng)

4、元的作用：與正常對照組(275.2±65.11)相比較，腦缺血損傷可使紋狀體ChAT陽性細胞明顯減少(118.10±74.33，P=0.000)，損傷后2h治療組可明顯阻止紋狀體膽堿能神經(jīng)元丟失(184.14±46.47，P=0.036)，但損傷后6h治療組無此作用(127.00±47.06，P=0.759)。 2、亞低溫對GABA能神經(jīng)元的作用：與正常對照組(253.80±40.97)相比，損傷組紋狀體內(nèi)GAD陽性神經(jīng)元明顯減

5、少(41.804±26.94，P=0.001)，損傷后2h開始亞低溫治療(110.86±61.00，P=0.003)可顯著減少GAD陽性神經(jīng)元丟失，損傷后6h開始低溫治療(81.75±41.19)對GAD神經(jīng)元有一定保護作用，但與損傷組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.059)。損傷組紋狀體內(nèi)Calbindin-28kd陽性神經(jīng)元([48.79±26.2]mm-2)與正常對照組([221.82±44.92]mm-2)相比明顯減少(P=0.

6、000)，損傷后2h開始亞低溫治療([129.01±45.55]mm-2)可減少Calbindin-28kd陽性神經(jīng)元丟失(P=0.001)，但如損傷后6h開始低溫治療([75.15±30.55]mm-2)對Calbindin-28kd陽性神經(jīng)元無保護作用(P=0.132)。損傷組紋狀體內(nèi)NPY陽性神經(jīng)細胞(94.00±55.29)較正常對照組(258.80±62.69，P=0.001)明顯減少，與損傷組比較，損傷后2h低溫治療組陽性神

7、經(jīng)元(186.86±63.06)明顯增加(p=0.007)，而損傷后6h低溫治療組NPY陽性神經(jīng)細胞較損傷組無明顯增加(123.13±77.07，P=0.351)。 3、亞低溫對一氧化氮神經(jīng)元的作用：與正常對照組(248.00±59.49)比較，缺氧缺血后，紋狀體內(nèi)nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少(76.60±33.11，P=0.000)，但其陽性神經(jīng)細胞形態(tài)上無明顯改變；與損傷組比較，損傷后2h低溫治療組(133.00±38.7

8、4，P=0.028)和損傷后6h低溫治療組(127.38±65.18，P=0.039)均使nNOS陽性細胞數(shù)增加。 結(jié)論：亞低溫對胎羊缺血性腦損傷紋狀體不同表型的神經(jīng)元具有保護作用，這一作用與低溫治療開始實施的時間有關(guān)，損傷后2h即開始早期治療具有神經(jīng)保護作用，但損傷后延遲開始治療的時間則無效。亞低溫對紋狀體不同表型的神經(jīng)元均具有一定的保護作用，可能為低溫治療可改善運動功能和學(xué)習記憶能力的機制。 第二部分選擇性頭部降溫對

9、胎羊缺血性腦損傷紋狀體神經(jīng)元保護作用的機制。 目的：研究選擇性頭部降溫對缺血性腦損傷胎羊紋狀體神經(jīng)元凋亡和星形膠質(zhì)細胞增殖的影響，探討低溫治療的腦保護機制。 方法：胎羊于妊娠117-124天(足月為147天)時通過雙側(cè)頸動脈阻塞30min造成雙側(cè)腦缺血損傷，損傷后將胎羊隨機分為：損傷組(n=10)、2h低溫組(損傷后2h開始亞低溫治療，n=7)和6h低溫組(損傷后6h開始亞低溫治療，n=8)，另設(shè)正常對照組(n=5)。通

10、過冷循環(huán)水進行選擇性頭部降溫，維持硬膜外溫度為30-33℃，持續(xù)72h。實驗結(jié)束，經(jīng)剖宮產(chǎn)取出胎羊，固定腦組織。用免疫組化法檢測胎羊紋狀體半胱天冬氨酸酶-3(Caspase-3)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和增殖細胞核抗原(PCNA)的表達。 結(jié)果：1、亞低溫對紋狀體神經(jīng)元凋亡的作用：正常對照組中，Caspase-3表達極少(11.00±13.77)，損傷組Caspase-3免疫陽性細胞為177.70±48.69，較正常組明顯

11、增加(P=0.000)，損傷后2h治療組中免疫陽性細胞明顯減少(54.14±39.44，P=0.000)，損傷后6h治療組也能減少Caspase-3免疫陽性細胞(122.43±52.36，P=0.017)。 2、亞低溫對腦損傷紋狀體星形膠質(zhì)細胞增殖的影響：與正常對照組(163.40±21.98)相比，缺血性腦損傷組的GFAP免疫陽性細胞明顯增多(433.25±66.69，P=0.000)，損傷后2h開始亞低溫治療可以減少GFAP

12、免疫陽性細胞(219.50±35.31，P=0.000)，損傷后6h開始亞低溫治療也能減少GFAP免疫陽性細胞(272.50±86.20，P=0.000)。 3、亞低溫對腦損傷紋狀體PCNA陽性細胞的影響：在正常對照組中，PCNA免疫陽性細胞較少，為153.40±12.46，缺血性腦損傷組的PCNA免疫陽性細胞明顯增多(353.70±45.60，p=0.000)，損傷后2h開始亞低溫治療可以減少PCNA免疫陽性細胞(187.14

13、+26.26，p=0.000)，損傷后6h開始亞低溫治療也能減少PCNA免疫陽性細胞(230.25±67.46，P=0.000)。 結(jié)論：亞低溫可以抑制紋狀體神經(jīng)元的凋亡和星形膠質(zhì)細胞的增殖，這可能為選擇性頭部降溫對紋狀體的腦保護作用機制之一。 結(jié)論：1 亞低溫治療可以減少缺血性腦損傷紋狀體膽堿能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元和一氧化氮神經(jīng)元的丟失。 2 亞低溫治療可以抑制缺血性腦損傷紋狀體神經(jīng)元的凋亡和星形膠質(zhì)細胞的