土鱉蟲纖溶成分的提取和基因克隆的研究.pdf

1、土鱉蟲為傳統(tǒng)活血化淤類中藥,首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被廣泛用于治療血滯經(jīng)閉、淤血腹痛和因跌打損傷引起的血淤不通等病癥,治療效果顯著。然而迄今,未見到對土鱉蟲抗血栓機理的深入研究,土鱉蟲體內(nèi)的纖溶活性成分也未被完全分離純化出來,這對充分開發(fā)祖國醫(yī)學這一寶貴動物藥材,研制高效低副作用抗血栓藥物造成了極大困難。本文通過生化分離手段,從土鱉蟲體內(nèi)提取純化出三種具有纖溶活性的物質(zhì),并對其中一種進行了生化性質(zhì)的研究,并在此基礎上深入至分子水平,對土鱉

2、纖溶活性成分進行了基因克隆和分析。
　　本研究中,首先通過硫酸銨分段沉淀、DEAE-纖維素柱和Sephadex G-75柱層析從活雌性地鱉體內(nèi)分離純化得到一種纖溶酶原激活物(EFF-1),該激活物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,顯示為一條帶,其分子量為41.3KD,含糖量為10.5％。其水解纖維蛋白的比活力為547.9U/mg,進一步研究表明,該成分屬于絲氨酸蛋白酶類。此外,通過制備電泳法,從活雌性土鱉體內(nèi)分離純化到另外兩種纖溶成分:

3、 EFF-2、EFF-3,分子量分別為32.9KD和30.6KD,比活力為234.0U/mg和148.5U/mg,EFF-2和EFF-3均具有直接纖溶酶活性,提示它們?yōu)樾碌木哂欣w溶酶活性的蛋白酶。
　　其次根據(jù)已登陸NCBI網(wǎng)站的蚯蚓纖溶酶、蜈蚣纖溶激酶和人的激肽釋放酶的氨基酸保守序列設計出一對簡并引物,用RT-PCR的方法從土鱉體內(nèi)克隆到一段長度為434bp基因序列,共編碼144個氨基酸,經(jīng)蛋白質(zhì)Blastp比對,證實獲得的氨基

4、酸序列為胰蛋白酶家族成員,與多種動物的胰蛋白酶有較高的同源性,與蚯蚓纖溶酶、蜈蚣纖溶酶激酶及人類激肽釋放酶的蛋白質(zhì)序列有一定的同源性,保守序列也一致,證明所克隆出來的cDNA序列是土鱉胰蛋白酶的一段核苷酸序列,為首次發(fā)現(xiàn)的基因,記為序列一,命名為ET-I;再跟據(jù)上述蚯蚓纖溶酶、蜈蚣纖溶激酶的成熟肽N端氨基酸保守序列和序列一設計出一對簡并引物,從土鱉蟲體內(nèi)克隆到一段長度為535bp基因,其氨基酸序列與序列一有81%的一致性,為另一種胰蛋白

5、酶家族成員,同樣與多種動物的胰蛋白酶有較高的同源性。根據(jù)序列二,運用3'末端快速擴增法(3'RACE)法成功克隆出序列二的3'端序列,記為序列三。將序列二和序列三進行拼接,得出完整成熟肽,記為序列四,命名為ET-II。ET-II共815bp,含Poly(A)序列。終止子為TAA。ET-II成熟肽共編碼224個氨基酸,預測其成熟肽分子量為24640Da。將ET-II氨基酸序列遞交NCBI進行Blastp比對,結(jié)果顯示其為胰蛋白酶類絲氨酸蛋

6、白酶,與蜜蜂絲氨酸蛋白酶、德國小蠊胰蛋白酶有很高的同源性,與蜈蚣纖溶酶激酶、人纖溶系統(tǒng)相關的激肽釋放酶和粉正蚓纖溶酶、赤子愛勝蚓纖溶酶酶等也有一定的同源性。至此,本實驗獲得了兩段基因,一段為中間序列,另一段為含3'末端的成熟肽完整序列,這兩段基因翻譯而成的蛋白是否有纖溶活性還需在獲得全長基因后表達鑒定才能確定。
　　土鱉蟲為傳統(tǒng)活血破淤的中藥,動物試驗證明土鱉蟲粗提物具有溶解靜脈血栓,抑制血小板聚集,抗凝血的作用。本文運用生化方法