13147.地鱉蟲和黃粉蟲纖溶活性蛋白的分離純化、性質(zhì)研究及其基因克隆

1、分類號：UDC：密級：學校代號：11845學號：1120806002廣東工業(yè)大學博士學位論文(工學博士)地鱉蟲和黃粉蟲纖溶活性蛋白的分離純化、性質(zhì)研究及其基因克隆黃明星指導教師姓名、職稱：瑩雅菹教授企業(yè)導師姓名、職稱：無專業(yè)或領域名稱：廑且化堂學生所屬學院：輕工化工堂院論文答辯日期：2Q12生12且2Q目摘要地鱉蟲(Eupolyphagesinensis)，又名土鱉蟲、土元等，昆蟲綱(Hexapeda)蜚蠊目(Blattada)鱉蠊科(

2、Corydiidae)蟲，為《中華人民共和國藥典》記載的正品藥材。地鱉蟲在中藥中被使用具有悠久歷史，中國明代李時珍的《本草綱目》，東漢著名醫(yī)學家張仲景的《金匱要略》和漢代的藥物著作《神農(nóng)本草經(jīng)》等均有記載。地鱉蟲歷來都做為傳統(tǒng)的活血化瘀類動物藥，現(xiàn)代生化分子及藥理試驗也證明了地鱉蟲具有抗凝血、抗腫瘤、抑制血小板聚集、溶解靜脈血栓等藥效。黃粉蟲(Tenebriomolitor)俗稱黃粉甲、面包蟲，屬于昆蟲綱(Insect)，鞘翅目(Col

3、eopter)，擬步甲科(Tenebrionide)粉甲屬(Tenebrionini)，原產(chǎn)于南美洲，屬于倉庫和貯藏害蟲。因其營養(yǎng)成分高，營養(yǎng)含量居各類活體動物蛋白飼料之首，被譽為“蛋白質(zhì)飼料寶庫“。近年來，黃粉蟲被逐步開發(fā)為寵物飼料，以及應用于人類的高級營養(yǎng)食品。地鱉蟲和黃粉蟲體內(nèi)不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸和其它小分子次生代謝物，同時還含有豐富的纖維蛋白溶解酶類，分離純化這些纖溶活性蛋白并研究它們的性質(zhì)對開發(fā)新型溶栓藥物具有重

4、要的意義。本文首先研究了纖溶活性蛋白的檢測方法：纖維平板法(fibrinplatemethod)和纖維蛋白酶譜法(fibrinzymography)。其中，纖維平板法可以用來快速地定性和半定量檢測纖溶活性蛋白。本文對該方法中的幾個關鍵因素做了詳細的研究和探討。纖維蛋白酶譜法是一種基于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的方法，我們通過對該方法中幾個關鍵因素的研究和討論，得到了一種有效而簡便的方法，可以讓蛋白分子量標準的深藍色條帶和纖溶蛋白激活物

5、的透明裂解帶同時在淡藍色的背景下顯示出來。此方法能快速的檢測出未知樣品中纖溶活性蛋白的種類、數(shù)量和分子量，從而為后期的純化提供更有價值的信息。其次，我們從地鱉蟲體內(nèi)分離純化出了一種纖溶活性蛋白。通過30％70％的硫酸銨梯度沉淀、Sephacryl$200HR分子篩、DEAESepharoseFF離子柱和BenzamidineSepharose6B親和純化，最后分離出了地鱉蟲體內(nèi)含量最大的一種纖溶活性蛋白，該蛋白被命名為ESTL。最終的純