孤核受體NR4A1抵抗活性氧所致胰島β細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 在胰島β細(xì)胞中過表達(dá)NR4A1可抵抗活性氧所致的細(xì)胞凋亡
　　研究目的:
　　探討活性氧分子H2O2是否能誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞內(nèi)NR4A1的表達(dá)以及過表達(dá)NR4A1是否可抵抗活性氧所致的胰島β細(xì)胞凋亡。
　　研究方法:
　　1.用不同濃度的H2O2（0μM、50μM、100μM、200μM、400μM）處理MIN6細(xì)胞1小時，收取細(xì)胞，提取RNA或蛋白質(zhì)，分別用熒光定

2、量PCR(Q-PCR)和Western blot檢測不同濃度H2O2處理MIN6細(xì)胞時，NR4A1在mRNA和蛋白水平的改變以及Caspase3的活性形式在蛋白水平的變化。
　　2.用100μM H2O2處理MIN6細(xì)胞，分別在不同時間點(diǎn)[0h、1h、3h、5h(RNA)、7h、9h、12h（蛋白質(zhì)）]收取細(xì)胞，提取RNA或蛋白質(zhì)，分別用熒光定量PCR(Q-PCR)和Western blot檢測不同時間點(diǎn)NR4A1在mRNA和蛋白

3、水平的變化以及Caspase3活性形式蛋白水平的變化。
　　3.構(gòu)建高表達(dá)NR4A1的慢病毒感染MIN6細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選并獲得穩(wěn)定高表達(dá)NR4A1的MIN6細(xì)胞克隆（OV細(xì)胞）;用同樣方法獲得對照細(xì)胞(NC細(xì)胞)。用不同濃度的H2O2(0μM、100μM、200μM、400μM、600μM)處理OV及NC細(xì)胞4小時，用MTT方法檢測兩組細(xì)胞的存活率;用100μM H2O2處理兩組細(xì)胞不同時間(0h、1h、2h、4h、6h)，用

4、MTT方法檢測兩組細(xì)胞的存活率。
　　研究結(jié)果:
　　1.用不同濃度的H2O2處理MIN6細(xì)胞1小時后，NR4A1的mRNA和蛋白水平表達(dá)升高，50μM H2O2就能引起NR4A1mRNA水平的明顯升高，100μM H2O2能使NR4A1的表達(dá)到達(dá)峰值，蛋白水平隨著H2O2濃度的升高呈劑量效應(yīng);Caspase3活性形式在蛋白水平也明顯升高，說明H2O2能致使MIN6細(xì)胞凋亡。
　　2.用100μM H2O2處理MIN6

5、細(xì)胞，在不同時間點(diǎn)可觀察到NR4A1的mRNA和蛋白水平表達(dá)升高，mRNA水平在1h即達(dá)到高峰，蛋白水平在3h即有明顯升高，9h達(dá)到高峰;Caspase3活性形式的蛋白水平隨著時間的延長而升高，說明100μM H2O2可導(dǎo)致MIN6細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　3.成功地構(gòu)建過表達(dá)NR4A1的穩(wěn)定MIN6細(xì)胞株，即OV細(xì)胞，對照細(xì)胞為NC細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示，無論是加入不同濃度的H2O2還是加入相同濃度H2O2處理不同時間，OV細(xì)胞的存活率

6、都明顯高于NC細(xì)胞。
　　研究結(jié)論:
　　1.在MIN6細(xì)胞中，加入活性氧H2O2后，能夠誘導(dǎo)NR4A1的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)升高。
　　2.過表達(dá)NR4A1能夠抑制H2O2引起的胰島β細(xì)胞凋亡;敲除NR4A1的小鼠胰島細(xì)胞內(nèi)更容易積累氧自由基，更容易引起凋亡。
　　3.加入H2O2后，NR4A1是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮抗凋亡作用，而非細(xì)胞質(zhì)。
　　第二部分 NR4A1抵抗活性氧所致胰島β細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研

7、究
　　研究目的:
　　研究NR4A1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)哪些分子來抵抗H2O2引起的胰島β細(xì)胞凋亡。
　　研究方法:
　　1.培養(yǎng)過表達(dá)NR4A1的穩(wěn)定MIN6細(xì)胞（OV細(xì)胞）和對照細(xì)胞（NC細(xì)胞），收集細(xì)胞，分別提取RNA和蛋白，利用Q-PCR檢測抗氧化分子、抗凋亡分子GPX1、CAT、SOD1、SOD2、WT1、ERG1在mRNA水平的表達(dá)量變化，用Western blot檢測抗氧化、抗凋亡分子SOD1、SOD2

8、、WT1、Bcl-2、SIRT1在蛋白水平的表達(dá)量變化。
　　2.用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建高表達(dá)NR4A1-HA的重組腺病毒。分別用高表達(dá)NR4A1的腺病毒感及對照病毒感染培養(yǎng)的MIN6細(xì)胞48小時，收集細(xì)胞，分別提取RNA和蛋白，利用Q-PCR檢測NR4A1、WT1表達(dá)量的變化，用Western blot檢測抗氧化、凋亡分子SOD1、SOD2、WT1、Bcl-2在蛋白水平的表達(dá)量變化。
　　3.用100μM H2O2處理過表

9、達(dá)NR4A1的穩(wěn)轉(zhuǎn)MIN6細(xì)胞（OV細(xì)胞）及對照細(xì)胞(NC細(xì)胞)，分別在不同時間點(diǎn)(0h、1h、3h、7h、9h、12h)收集細(xì)胞，提取蛋白，Western blot檢測p-JNK表達(dá)量的變化。
　　4.用100μM H2O2處理OV及NC細(xì)胞，分別在不同時間點(diǎn)(0h、1h、3h、7h、9h、12h)收集細(xì)胞，提取蛋白，用Western blot檢測SOD1、SOD2表達(dá)量的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.在過表達(dá)NR

10、4A1的細(xì)胞（OV細(xì)胞）中抗氧化分子GPX1、CAT、SOD1、WT1、ERG1在mRNA水平顯著高于對照細(xì)胞(NC細(xì)胞)，SOD2 mRNA水平無明顯變化;SOD1、WT1、Bcl-2的蛋白水平在OV細(xì)胞中顯著高于對照細(xì)胞，SOD2、SIRT1蛋白水平無明顯變化。通過查看WT1的啟動子的序列，發(fā)現(xiàn):WT1啟動子上有一個NR4A1的結(jié)合位點(diǎn)（-1118bpto-1111bp）。
　　2.成功構(gòu)建表達(dá)C-端帶有HA標(biāo)簽(tag)的N

11、R4A1腺病毒(Ad-NR4A1-HA)，感染MIN6細(xì)胞能夠達(dá)到近100％的感染率。用上述腺病毒及對照病腺毒感染培養(yǎng)的MIN6細(xì)胞48小時后，Q-PCR結(jié)果顯示感染Ad-NR4A1-HA的細(xì)胞NR4A1、WT1的mRNA表達(dá)量顯著高于對照病毒感染的細(xì)胞;Western blot結(jié)果顯示，感染Ad-NR4A1-HA的細(xì)胞中SOD1、Bcl-2、WT1的蛋白水平顯著高于對照病毒感染的細(xì)胞，SOD2蛋白水平無明顯變化。
　　3.100

12、μM H2O2處理OV細(xì)胞和NC細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示，JNK的磷酸化水平在OV細(xì)胞中顯著低于NC細(xì)胞，說明JNK的激活在OV細(xì)胞中受到抑制。
　　4.100μM H2O2處理OV細(xì)胞和NC細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示，在各個時間點(diǎn)OV細(xì)胞SOD1的蛋白表達(dá)量都遠(yuǎn)高于NC細(xì)胞，而SOD2的蛋白表達(dá)量在OV和NC細(xì)胞間無明顯變化。
　　研究結(jié)論:
　　1.NR4A1抵抗H2O2引起的MIN6

13、細(xì)胞凋亡中，與抗氧化蛋白PPARγ、SIRT1、NF-κB無關(guān)。
　　2.NR4A1上調(diào)WT1、SOD1的表達(dá)量以抑制H2O2引起的MIN6細(xì)胞凋亡。
　　3.NR4A1能夠抑制H2O2引起JNK磷酸化而抵抗細(xì)胞凋亡。
　　4.NR4A1和WT1基因的啟動子有物理結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性。通過文獻(xiàn)檢索查找發(fā)現(xiàn)WT1能夠直接上調(diào)SOD1、Bcl-2的表達(dá)量;而pJNK能抑制SOD1的表達(dá)。綜述所述，NR4A1通過兩條途徑上調(diào)

14、SOD1:1）通過直接上調(diào)WT1的表達(dá);2)通過抑制JNK的磷酸化。
　　第三部分 NR4A1下游分子WT1和SURVIVIN在抵抗活性氧所致胰島β凋亡中的作用
　　研究目的:
　　進(jìn)一步確定WT1對SOD1、Bcl-2的調(diào)控以及SURVIVIN能否抵抗H2O2引起的MIN6細(xì)胞凋亡。
　　研究方法:
　　1.構(gòu)建靶向WT1的小干擾RNA的慢病毒，通過感染MIN6細(xì)胞，藥物（嘌呤霉素）篩選得到WT1蛋白表達(dá)

15、敲低的細(xì)胞株（WT1-KD），同時，用對照慢病毒得到對照細(xì)胞株(CON)。Western blot檢測KD和CON細(xì)胞內(nèi)WT1、Bcl-2、SOD1蛋白表達(dá)量;用不同濃度的H2O2（0μM、100μM、200μM、400μM）處理兩組細(xì)胞4小時，用MTT方法檢測兩組細(xì)胞的存活率。
　　2.用100μM H2O2處理敲低WT-KD對照細(xì)胞，分別在不同時間點(diǎn)(0h、3h、6h、9h、12h)收集樣品，用Western blot檢測不同

16、時間點(diǎn)Caspase 3活性形式蛋白水平的變化。
　　3.用上述類似的方法得到SURVIVIN敲低的細(xì)胞(SURVIVIN-KD)及對照細(xì)胞(CON)，用Western blot檢測兩株細(xì)胞內(nèi)SURVIVIN蛋白表達(dá)量;用不同濃度的H2O2 (0μM、100μM、200μM、400μM)處理兩組細(xì)胞4小時，用MTT方法檢測兩組細(xì)胞的存活率。
　　研究結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建敲低WT1的MIN6細(xì)胞株（WT1-KD細(xì)胞）

17、及對照細(xì)胞（CON細(xì)胞）。Western blot結(jié)果顯示在WT1-KD細(xì)胞中WT1、Bcl-2、SOD1表達(dá)量顯著低于對照細(xì)胞;MTT結(jié)果顯示，WT1-KD細(xì)胞的凋亡率顯著高于對照組細(xì)胞的凋亡率。
　　2.用100μM H2O2處理WT1-KD細(xì)胞和CON細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示，Caspase 3（活性形式）蛋白水平隨著時間的延長而升高，但是各個時間點(diǎn)WT1-KD細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于CON細(xì)胞的表達(dá)量。

18、>　　3.成功構(gòu)建敲低SURVIVIN蛋白表達(dá)的MIN6細(xì)胞株(SURVIVIN-KD)及對照細(xì)胞(CON細(xì)胞)。Western blot結(jié)果顯示在SURVIVIN-KD細(xì)胞中SURVIVIN表達(dá)量顯著低于對照細(xì)胞;MTT結(jié)果顯示，SURVIVIN-KD細(xì)胞的凋亡率顯著高于CON細(xì)胞的凋亡率。
　　研究結(jié)論:
　　1.WT1通過調(diào)控Bcl-2、SOD1抵抗H2O2引起的MIN6細(xì)胞凋亡。
　　2.SURVIVIN同樣抵