肝癌干細(xì)胞分離和穩(wěn)定培養(yǎng)體系的建立及化療藥物對其作用.pdf

1、背景：全球腫瘤發(fā)病率呈逐漸增高趨勢，嚴(yán)重威脅人類生命。消化系統(tǒng)腫瘤，如肝癌，胃癌，食管癌，結(jié)直腸癌，胰腺癌等發(fā)病率在全球范圍內(nèi)也始終居高不下 。傳統(tǒng)的手術(shù)及放化療等手段對腫瘤治療療效有限，而且腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移也是治療難點(diǎn)，因此積極探索腫瘤治療的新方法有極其重要的意義。
　　 近年來腫瘤干細(xì)胞成為腫瘤研究熱點(diǎn)，腫瘤干細(xì)胞是一群存在于一些腫瘤組織中數(shù)目極少的干細(xì)胞樣細(xì)胞，具有自我更新和無限分化潛能，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥

2、的根源 。目前主要通過細(xì)胞表面標(biāo)志物來識別腫瘤干細(xì)胞。
　　 研究腫瘤干細(xì)胞的首要問題就是分離純化，以及建立穩(wěn)定培養(yǎng)體系。另外，腫瘤干細(xì)胞對放化療不敏感，造成腫瘤治療的難點(diǎn)。本課題選擇發(fā)病率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第二的肝癌，進(jìn)行肝癌干細(xì)胞的分離純化并穩(wěn)定培養(yǎng)，以此探索消化道腫瘤干細(xì)胞分離及建立穩(wěn)定培養(yǎng)體系的方法，并觀察化療藥物對腫瘤干細(xì)胞的作用，為今后腫瘤干細(xì)胞研究以及腫瘤靶向治療奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分肝癌干細(xì)胞的

3、分離和鑒定
　　 目的：利用肝癌腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物來分離腫瘤干細(xì)胞,為腫瘤干細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)體系的建立打下基礎(chǔ)。方法：選取肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，用免疫磁珠的方法分選表達(dá)CD133 的細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞檢測分選的純度，分選后的細(xì)胞進(jìn)行一段時(shí)間的培養(yǎng)后再檢測其表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果：分選后通過流式檢測陽選細(xì)胞CD133 表達(dá)量為48.73％，陰選細(xì)胞CD133 表達(dá)量為0.81％，分選后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)一周以后，陽選細(xì)胞C

4、D133 表達(dá)下降，而陰選細(xì)胞無改變。結(jié)論：利用CD133 作為腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志，成功分離肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 中的腫瘤干細(xì)胞群體。
　　 第二部分肝癌腫瘤干細(xì)胞與非腫瘤干細(xì)胞體內(nèi)外增殖能力的比較
　　 目的：比較肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 的CD133+和CD133-亞群的生物學(xué)特性，通過體外增殖能力、體內(nèi)成瘤能力來證明CD133+亞群細(xì)胞更具有腫瘤干細(xì)胞樣的特性。方法：通過平板克隆形成試驗(yàn)比較SMMC-7

5、721細(xì)胞CD133+和CD133-亞群的體外增殖能力，通過裸鼠成瘤試驗(yàn)比較兩個(gè)亞群的體內(nèi)成瘤能力。結(jié)果：分別將500 個(gè)CD133+和CD133-單細(xì)胞接種培養(yǎng)，兩周后計(jì)算克隆形成率CD133+大于CD133-細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；將106 個(gè)CD133+和CD133-細(xì)胞接種在裸鼠皮下，四周后觀察成瘤情況并測量瘤體大小，CD133+細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯大于CD133-細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)論

6、：肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 的CD133+亞群體外增殖能力和體內(nèi)成瘤能力均大于CD133-亞群，CD133+亞群更具有腫瘤干細(xì)胞樣特性。
　　 第三部分抗腫瘤藥物對肝癌腫瘤干細(xì)胞和非腫瘤干細(xì)胞抑制作用的比較
　　 目的：比較抗腫瘤藥物對肝癌SMMC-7721 細(xì)胞CD133+和CD133-亞群的抑制作用。方法：選用經(jīng)典的抗腫瘤藥物5-FU,采用CCK-8 法在藥物作用48 小時(shí)后檢測OD 值，并計(jì)算藥物對細(xì)胞的抑制率