肺動(dòng)脈高壓患者蛋白質(zhì)組學(xué)及預(yù)后研究.pdf

1、第一部分:特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者肺組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究及Transgelin表達(dá)差異驗(yàn)證
　　目的:特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH)是指由不明原因引起的肺血管疾病，其主要特征是肺血管重塑，肺動(dòng)脈壓力漸進(jìn)性增高，目前發(fā)病機(jī)制尚未清楚。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展和完善，使人們可以組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)整體表達(dá)水平研究疾病。本研究應(yīng)用iTRAQ多重化學(xué)標(biāo)記-串

2、聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，觀察分析正常對(duì)照組與特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者肺組織差異蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)組學(xué)水平探討肺動(dòng)脈高壓形成機(jī)制。
　　方法:入選6例接受肺移植手術(shù)的IPAH患者，在術(shù)中取肺組織標(biāo)本;并入選6名需接受肺部或臨近部位手術(shù)，可取得肺組織的患者作為正常對(duì)照組。入選的IPAH患者均進(jìn)行右心導(dǎo)管檢查確診存在肺動(dòng)脈高壓。提取肺組織總蛋白，bradford方法定量。丙酮沉淀蛋白以及胰蛋白酶酶解之后，用iTRAQ試劑標(biāo)記，對(duì)照組，IPAH組分別用11

3、4，115標(biāo)記。用AB SCIEX TripleTOF5600質(zhì)譜儀檢測差異蛋白，獲得差異蛋白的一級(jí)質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖。對(duì)鑒定到的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)行蛋白質(zhì)功能富集分析，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，以及蛋白質(zhì)相互作用通路分析。根據(jù)生物信息學(xué)結(jié)果和文獻(xiàn)閱讀，選取可能與IPAH發(fā)病機(jī)制有關(guān)的差異蛋白，進(jìn)行免疫組化和免疫印跡研究。
　　結(jié)果:1.共鑒定差異蛋白112個(gè)，與正常對(duì)照組相比，在IPAH組上調(diào)≥1.5倍的蛋白48個(gè)，下

4、調(diào)≥1.5倍的蛋白64個(gè)。
　　2.蛋白質(zhì)功能富集分析顯示差異表達(dá)蛋白質(zhì)參與的主要生物學(xué)過程包括對(duì)損傷的反應(yīng)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的組織、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞骨架的組織等。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示，這些蛋白質(zhì)參與的相互作用網(wǎng)絡(luò)主要集中在8個(gè)網(wǎng)絡(luò)模塊:免疫調(diào)節(jié)、對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)的反應(yīng)、發(fā)育過程、對(duì)生長因子及有機(jī)體的反應(yīng)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)、翻譯蛋白的膜錨定和核膜分解過程等。差異蛋白相互作用主要通路如下:細(xì)胞骨架相關(guān)通路、凝血相關(guān)通路、血紅素代謝相關(guān)通路和

5、細(xì)胞增殖等。
　　3.蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)IPAH患者肺組織中Transgelin(轉(zhuǎn)凝蛋白)表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(IPAH/對(duì)照=5.105倍，P=0.000)，免疫組化研究顯示Transgelin在特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者Transgelin表達(dá)明顯升高，且主要表達(dá)于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，免疫印跡顯示特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者Transgelin表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P=0.017）。
　　結(jié)論本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)，比較了正常對(duì)照

6、和IPAH患者肺組織的差異蛋白，共鑒定112個(gè)差異蛋白，免疫組化和免疫印跡驗(yàn)證Transgelin在IPAH患者肺組織中表達(dá)上調(diào)，可能與IPAH的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。
　　第二部分:先天性心臟病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓肺組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　目的:肺動(dòng)脈高壓（Pulmonary arterial hypertension，PAH）是先天性體-肺分流性心臟病最常見的并發(fā)癥。大約5％-10％的CHD患者最終發(fā)展為肺動(dòng)脈高壓，對(duì)于已經(jīng)形成PA

7、H，但尚未發(fā)展為艾森曼格綜合癥的先心病患者，在實(shí)施手術(shù)干預(yù)之前，難以準(zhǔn)確判斷肺血管病變的性質(zhì)及是否具有可逆性。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展和完善，使人們可以在組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)整體表達(dá)水平研究疾病。本研究應(yīng)用iTRAQ多重化學(xué)標(biāo)記-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，觀察分析先心病術(shù)后肺動(dòng)脈高壓可逆的患者與肺動(dòng)脈高壓不可逆的患者肺組織中的差異蛋白，在蛋白質(zhì)組學(xué)水平探討先心病術(shù)后PAH可逆的分子學(xué)機(jī)制。
　　方法:入選具有外科修補(bǔ)術(shù)適應(yīng)證的先心病患者，

8、并于患者接受外科手術(shù)時(shí)在手術(shù)中切取肺組織;正常對(duì)照組患者在接受胸科手術(shù)時(shí)切取正常肺組織作為正常對(duì)照組肺組織標(biāo)本。對(duì)進(jìn)行外科修補(bǔ)術(shù)的先心病患者進(jìn)行隨訪，于術(shù)后一年復(fù)查右心導(dǎo)管，右心導(dǎo)管測定肺動(dòng)脈平均壓(mPAP)＜25 mmHg者為先心病患者肺動(dòng)脈高壓可逆組，mPAP≥25 mmHg者為先心病患者肺動(dòng)脈高壓不可逆組。提取肺組織總蛋白，bradford方法定量。丙酮沉淀蛋白以及胰蛋白酶酶解之后，用iTRAQ試劑標(biāo)記。用AB SCIEXTri

9、pleTOF5600質(zhì)譜儀檢測差異蛋白，獲得差異蛋白的一級(jí)質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖。對(duì)鑒定到的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)行蛋白質(zhì)功能富集分析、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析以及蛋白質(zhì)相互作用通路分析。根據(jù)生物信息學(xué)結(jié)果和文獻(xiàn)閱讀，選取可能與先心病PAH可逆機(jī)制有關(guān)的差異蛋白。
　　結(jié)果:共鑒定差異蛋白160個(gè)，與先心病PAH可逆組相比，在先心病PAH不可逆組上調(diào)≥1.5倍的蛋白85個(gè)，下調(diào)≥1.5倍的蛋白75個(gè)。蛋白質(zhì)功能富集分析顯示差異表

10、達(dá)蛋白質(zhì)參與的主要生物學(xué)過程包括細(xì)胞黏附、生物附著、對(duì)損傷反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)吞正調(diào)節(jié)、肌動(dòng)蛋白絲介導(dǎo)過程、細(xì)胞基質(zhì)粘附、細(xì)胞骨架組織、肌動(dòng)蛋白骨架組織、急性炎癥過程、蛋白翻譯過程、血液凝固、穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和參與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)。這些蛋白質(zhì)參與的相互作用網(wǎng)絡(luò)主要集中在15個(gè)網(wǎng)絡(luò)模塊，主要是:免疫調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)信號(hào)通路、細(xì)胞組分結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、肌肉收縮、正調(diào)節(jié)蛋白代謝、病毒轉(zhuǎn)錄、正調(diào)節(jié)生物過程、補(bǔ)體激活、免疫反應(yīng)正調(diào)節(jié)和細(xì)胞對(duì)生長因子的反應(yīng)等。差異蛋白相互作

11、用主要通路如下:免疫反應(yīng)的補(bǔ)體通路、細(xì)胞黏附與遷移通路、細(xì)胞骨架重塑、內(nèi)皮細(xì)胞非縫隙鏈接接觸、凝血通路、HDL介導(dǎo)膽固醇反向轉(zhuǎn)運(yùn)、肺癌中TGF-β通路和整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞骨架重塑通路。
　　結(jié)論:本研究對(duì)先心病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓患者的肺組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)先心病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓患者術(shù)后PAH不可逆組和PAH可逆組相比，有160種蛋白質(zhì)表達(dá)量存在差異，其中在先心病PAH不可逆組中上調(diào)蛋白85個(gè)，下調(diào)蛋白75個(gè)。生物信息學(xué)研究

12、發(fā)現(xiàn)，較多蛋白質(zhì)與細(xì)胞骨架重塑和炎癥反應(yīng)相關(guān)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，篩選出的Caveolin-1、FilaminA以及Apolipoprotein A-I可能與先心病術(shù)后PAH不可逆相關(guān)，需進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　第三部分:體重指數(shù)評(píng)價(jià)特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者預(yù)后的研究
　　目的:“肥胖矛盾”，是指雖然肥胖與心血管疾病發(fā)病相關(guān)，但體重指數(shù)(body massIndex，BMI)較高的心血管病患者預(yù)后較好。尚未有研究關(guān)于體重指數(shù)與特發(fā)性肺動(dòng)

13、脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）患者預(yù)后關(guān)系的研究。本研究探索研究BMI對(duì)IPAH患者預(yù)后的作用。
　　方法:對(duì)入選的173例特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者進(jìn)行隨訪，以全因死亡為隨訪終點(diǎn)。將人群按國際BMI定義分類，分為低體重組(BMI＜18.5kg/m2)，正常體重組(18.5-24.9kg/m2)，超重和肥胖組（25-34.9 kg/m2）。先比較不同BMI水平人口

14、學(xué)特征和各項(xiàng)臨床指標(biāo)的差異，再應(yīng)用Kaplan-Meier曲線及Log-rank檢驗(yàn)對(duì)不同BMI人群的生存率進(jìn)行描述及比較，多因素Cox回歸用于分析BMI對(duì)IPAH患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測作用。
　　結(jié)果:平均隨訪時(shí)間隨訪為31個(gè)月，其中57例死亡。不同BMI水平組的患者在年齡、心功能分級(jí)、左心室舒張末期內(nèi)徑方面存在顯著差異，其中超重肥胖組的年齡較大，心功能分級(jí)較好，左心室舒張末期內(nèi)徑較大。三組人群的右心導(dǎo)管測試血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及血清NT

15、-proBNP方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。kaplan-meier生存曲線顯示，相對(duì)于正常體重組和低體重組，超重和肥胖組有更好的生存率（log-rank檢驗(yàn)，分別P=0.027，P=0.000）。多元COX回歸分析顯示低體重（P=0.001）、 WHO心功能分級(jí)差（P=0.046）、低心臟指數(shù)(P=0.000)、左室舒張末期內(nèi)徑?。≒=0.001）、未使用靶向藥物治療（P=0.000）都是預(yù)測IPAH患者預(yù)后較差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)論:

16、BMI較高的IPAH患者生存率較正常體重和低體重患者好。
　　第四部分:血清乳酸脫氫酶對(duì)特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者全因死亡風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測作用
　　目的:心力衰竭時(shí)肝功能損傷是導(dǎo)致血清乳酸脫氫酶(serum lactatedehydrogenase，S-LDH)增高的因素之一，而特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(idiopathicpulmonary arterial hypertension，IPAH)后期的主要特征是右心衰竭。本研究的目的是探索研究

17、S-LDH對(duì)IPAH患者預(yù)后的作用。
　　方法:連續(xù)入選2007年5月至2012年7月在阜外醫(yī)院住院的173名IPAH患者，男性48例，女性125例，平均年齡31±10歲。按照S-LDH正常界值(250 IU/L)，分為S-LDH正常組(S-LDH＜250 IU/L)以及S-LDH升高組(S-LDH≥250 IU/L)。對(duì)所有入選的患者都進(jìn)行了右心導(dǎo)管檢查，生化檢查在右心導(dǎo)管檢查的一周內(nèi)進(jìn)行。
　　結(jié)果:入選的173例IPA

18、H患者中，有53例(30.6％) IPAH患者S-LDH≥250 IU/L，為S-LDH升高組，120例患者S-LDH＜250 IU/L，為S-LDH正常組。兩組在性別、體重指數(shù)、肺毛細(xì)血管楔壓、血清肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及靶向藥物治療方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但S-LDH升高組與S-LDH正常組相比，前者心功能分級(jí)較差;右心房平均壓、肺動(dòng)脈平均壓、肺血管阻力、尿酸、總膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶和NT-proBNP較高;心指數(shù)以及混合靜脈血氧飽和度較低

19、。在平均31.2±17.9個(gè)月的隨訪時(shí)間中，一共57例患者死亡，其中S-LDH正常組中有20例(16.7％)的患者死亡，而S-LDH升高組中有37(69.8％)例患者死亡。kaplan-meier生存曲線顯示S-LDH升高組的預(yù)后顯著差于S-LDH正常組（log-rank檢驗(yàn)，P＜0.001）。在多因素COX生存分析中，低體重指數(shù)（P＜0.001）、低心臟指數(shù)(P＜0.001)、WHO心功能分級(jí)差(P=0.030)、高S-LDH（P=0

20、.002）以及缺乏靶向藥物治療(P＜0.001)是IPAH患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ROC曲線進(jìn)一步顯示S-LDH水平增高預(yù)示IPAH患者預(yù)后差，最佳的S-LDH預(yù)測介值是218.5 IU/l（敏感性，80％;特異性，70％）。曲線下面積0.778[95％可信區(qū)間(CI)，0.701-0.855]，而NT-proBNP的曲線下面積是0.642(95％ CI，0.555-0.730)。
　　結(jié)論:升高的血清乳酸脫氫酶是特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓