線粒體形態(tài)及Drp1在食管癌變中的探究.pdf

1、背景與目的：
　　癌組織中常?？梢杂^察到慢性炎癥的存在，而慢性炎癥又常常是造成氧化刺激及氧化損傷的關(guān)鍵。細(xì)胞內(nèi)ROS（氧自由基）產(chǎn)生的主要位置在線粒體內(nèi)，而慢性炎癥卻是細(xì)胞外ROS的主要來源。線粒體受到自身及外在炎性因子刺激必然會(huì)產(chǎn)生適應(yīng)性變化，這種變化首先應(yīng)發(fā)生在其結(jié)構(gòu)及形態(tài)上。研究表明，線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、數(shù)量變化及線粒體DNA（mtDNA）在癌組織中均發(fā)生了不同程度的改變，而Dynamin-related protein1（D

2、rp1）蛋白作為促進(jìn)線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白，參與線粒體分裂及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過程，與腫瘤預(yù)后有密切關(guān)系。抗線粒體抗體（Anti-Mitochondria antibody；MTC02）作為線粒體膜蛋白均勻分布于線粒體外膜上，可對(duì)線粒體的數(shù)量進(jìn)行客觀的評(píng)判。
　　本實(shí)驗(yàn)以免疫組化的方法檢測(cè)Drp1、MTC02在食管正常上皮、非典型增生上皮及癌組織中的表達(dá)情況，用Q-PCR方法檢測(cè)從單純?cè)錾氖彻苌掀さ桨┙M織各階段的線粒體拷貝數(shù)，并且分析

3、其與患者的臨床病理參數(shù)及預(yù)后聯(lián)系，初步探討線粒體形態(tài)在食管早期癌變過程中的變化及其與臨床預(yù)后的聯(lián)系。
　　材料與方法：
　　1、標(biāo)本：收集汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科2009-2014年間食管癌標(biāo)本195例，非癌標(biāo)本91例（正常粘膜71例，非典型增生20例）；收集有完整隨訪資料的食管癌患者臨床資料共95例。NE2及EC1細(xì)胞系。
　　2、HE染色：常規(guī)染色，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行組織學(xué)診斷。
　　3、顯微切割：將不同

4、級(jí)別的組織分別顯微切割，收集并提取總DNA。
　　4、Q-PCR:擴(kuò)增目的基因檢測(cè)線粒體拷貝數(shù)
　　5、免疫熒光：觀察線粒體的相對(duì)長(zhǎng)度
　　6、免疫組化：觀察組織中Drp1及線粒體的表達(dá)情況.
　　7、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：使用FSCapture及Nano Measurer1.2軟件對(duì)線粒體進(jìn)行相對(duì)長(zhǎng)度測(cè)量。SPSS19.0軟件進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均數(shù)差別比較采用t檢驗(yàn)，R×C表的資料采用x2檢驗(yàn)（理論數(shù)<5時(shí)，則用

5、Fisher精確檢驗(yàn)法），預(yù)后組間生存率差別使用Log-rank(Mantel-Cox) Test，顯著性標(biāo)準(zhǔn)定為：p≤0.05時(shí)為差異有顯著性，P≤0.0001時(shí)為差異有高度顯著性。
　　結(jié)果：
　　1、拷貝數(shù)結(jié)果
　　以拷貝數(shù)中位數(shù)作為分級(jí)，比較癌組織，非典型增生組織，單純?cè)錾M織，p<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且拷貝數(shù)從單純?cè)錾桨┙M織呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì)。
　　2、MTC02的IHC表達(dá)結(jié)果
　　食

6、管癌組織中，線粒體數(shù)量隨著食管癌進(jìn)展的加深而逐步遞增。正常組織與非典型增生組織相比，非典型增生的食管組織中MTC02表達(dá)遠(yuǎn)高于正常組織，p<0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且正常組織與癌組織比較，MTC02在癌組織中表達(dá)明顯高于正常組織,p<0.0001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，非典型增生組織與癌組織比較MTC02的表達(dá)無差異，p>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在與病人臨床資料比較上發(fā)現(xiàn)，MTC02表達(dá)與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、大體形

7、態(tài)、腫瘤分級(jí)均無關(guān)，p>0.05。
　　3、線粒體相對(duì)長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)
　　未處理EC1與未處理NE2細(xì)胞比較，MT相對(duì)長(zhǎng)度前者明顯低于后者，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.0001。未處理的NE2與經(jīng)過雙氧水處理后NE2相比較，前者M(jìn)T相對(duì)長(zhǎng)度高于后者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.0001。未處理EC1與經(jīng)過雙氧水處理后的NE2細(xì)胞比較，只有與處理后4h的NE2的MT值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.0001。
　　4、Drp1的IHC

8、表達(dá)結(jié)果
　　Drp1在NE2未處理細(xì)胞胞漿中表達(dá)較弱，而在H2O2處理后則表達(dá)明顯增強(qiáng)，EC1未處理細(xì)胞胞漿中表達(dá)明顯增強(qiáng)。與線粒體形態(tài)改變對(duì)應(yīng)。在正常上皮組織與癌組織的比較中，Drp1在癌組織中的表達(dá)明顯高于正常上皮組織，p<0.0001，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在與病人臨床資料比較上發(fā)現(xiàn)，Drp1表達(dá)與年齡、性別、腫瘤位置、胸腔轉(zhuǎn)移、腫瘤分級(jí)均無關(guān)，p>0.05。但在腹腔轉(zhuǎn)移比較中，轉(zhuǎn)移組Drp1表達(dá)高于非轉(zhuǎn)移組，p<0.05

9、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組Drp1表達(dá)顯著低于轉(zhuǎn)移組，p<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與臨床預(yù)后聯(lián)系可以發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Drp1與不良預(yù)后明顯相關(guān)，p<0.0001，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陰性表達(dá)的生存中值為45個(gè)月，而陽性表達(dá)的生存中值為13.5個(gè)月，兩者相差明顯。
　　結(jié)論：
　　1、線粒體形態(tài)、數(shù)量、拷貝數(shù)在食管癌變過程中發(fā)生了明顯改變，且隨著癌變的進(jìn)展而增多，提示癌變過程中氧化損傷加重使得線粒體發(fā)生了一系列