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文檔簡介
1、第一章PICT-1是一個與MDM2酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核仁蛋白,PICT-1作為MDM2的E3泛素化底物在外源性核糖體應激下通過泛素-蛋白酶體途徑被降解
目的:篩選新的能與鼠雙微基因2(The murine double minute,MDM2)酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的蛋白質(zhì),以進一步明確該結(jié)構(gòu)域在MDM2對P53負性調(diào)節(jié)中的作用機制,同時探索MDM2與第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and t
2、ensin homologdeleted on chromosome ten,PTEN)羧基末端結(jié)合蛋白-l(Proteininteracting with PTEN carboxy terminus-1,PICT-1)的相互作用關(guān)系。
方法:應用酵母雙雜交系統(tǒng),以MDM2的酸性結(jié)構(gòu)域為誘餌,篩選人腦cDNA文庫,探索能與之結(jié)合的蛋白,應用免疫共沉淀技術(shù)對候選蛋白質(zhì)PICT-1與MDM2結(jié)合的能力進行確認;核苷酸分析軟件對
3、PICT-1功能區(qū)進行分析;westem blotting技術(shù)用于比較PICT-1蛋白在不同組織來源的正常細胞和癌細胞中的表達差異;免疫熒光及western blotting技術(shù)探索PICT-1蛋白對于各種放化療藥物的應答反應并分析外源性核糖體應激條件下PICT-1蛋白被降解的分子生物學特征。用泛素化失活的MDM2 C464A點突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌細胞及采用MDM2和P53雙敲除的鼠成纖維細胞研究MDM2蛋白E3泛素化活性在PICT-1降解
4、過程中所起的作用。
結(jié)果:包括PICT-1在內(nèi)的20種蛋白質(zhì)在酵母雙雜交系統(tǒng)中能與MDM2的酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合,PICT-1與MDM2結(jié)合的能力被免疫共沉淀實驗所證實,PICT-1蛋白從氨基酸147至羧基尾端為與MDM2酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的區(qū)域。PICT-1是一個具有典型PEST結(jié)構(gòu)的細胞核仁內(nèi)蛋白質(zhì),在肺癌、乳腺癌、前列腺癌細胞中PICT-1蛋白表達量較正常細胞為低。在外源性核糖體應激條件下:一,PICT-1從核仁中位移至細胞核
5、,表現(xiàn)為時間和劑量依賴性的降解,這種降解可被蛋白酶體途徑抑制劑MG132所阻斷;二,MDM2泛素化失活的C464A點突變能使PICT-1的這種降解作用消失;三,PICT-1在野生型鼠成纖維細胞中被降解,卻不能在MDM2和P53雙敲除的鼠成纖維細胞中被降解。
結(jié)論:
(1) PICT-1是一個能與MDM2酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核仁內(nèi)蛋白質(zhì);
(2) PICT-l作為MDM2泛素化底物在外源性核糖體應激條
6、件下通過泛素-蛋白酶體途徑被特異性降解。
第二章過表達PICT-1對癌細胞生長影響及其機制研究
目的:研究過表達PICT-1對癌細胞生長影響及其機制。
方法:采用細胞克隆集成能力及生長曲線方法研究過表達PICT-1蛋白對非小細胞肺癌細胞及其他癌細胞生長的影響,采用免疫熒光及western blotting研究過表達PICT-1蛋白對癌細胞生長影響的作用機制。
結(jié)果:過表達PICT-
7、1可抑制非小細胞肺癌細胞A549(P53wt&pten wt)及及乳腺癌細胞MCF7(P53 wt&pten wt)的生長,但在非小細胞肺癌細胞H1299(P53 null& pten mutant)、骨肉瘤細胞U20S(P53 wt&pten null)及前列腺癌細胞PC3(P53 null& pten null)中表現(xiàn)不明顯,PICT-1過表達可通過抑制MDM2對P53的E3泛素化連接酶活性,繼而穩(wěn)定并激活P53蛋白。無論在有無P5
8、3的情況下,PICT-1蛋白過表達均能通過其羧基端穩(wěn)定MDM2,提示這種穩(wěn)定作用是P53轉(zhuǎn)錄活性非依賴性的。同時PICT-1可誘導MDM2從細胞核分布至細胞核仁中,使其失去與P53蛋白的作用機會。過表達PICT-l使抑癌蛋白ARF的半衰期由6小時延長為10小時。PICT-1蛋白過表達可穩(wěn)定PTEN蛋白;在外源性核糖體應激的條件下,同時過表達PTEN和PICT-1,二者可共同定位于細胞核中。
結(jié)論:
(1)過表
9、達PICT-1通過抑制MDM2對P53蛋白的泛素化連接酶活性,穩(wěn)定并激活P53蛋白,抑制非小細胞肺癌A549細胞及乳腺癌MCF7細胞生長
(2)過表達PICT-1還可以誘導MDM2分布至細胞核仁,延長ARF的半衰期,增強PTEN蛋白穩(wěn)定性,是一個功能多樣的抑癌蛋白。
(3)過表達PICT-1對癌細胞生長抑制作用在不同細胞中表現(xiàn)不同,可能與P53及PTEN等蛋白表達狀態(tài)密切相關(guān)。
第三章慢病毒介導
10、的PICT-1沉默抑制癌細胞生長機制研究
目的:探討慢病毒介導的PICT-1沉默對癌細胞生長的影響并闡明其作用機制。
方法:采用兩個不同靶序列構(gòu)建慢病毒shRNA載體特異性沉默PICT-1,并以鼠源PICT-1挽救實驗確認其特異性。以sh GFP為陰性對照,RT-PCR檢測PICT-1、P53及PTEN mRNA表達水平,Western blot檢測MDM2、P53、P21、B23及PTEN及磷酸化AKT蛋白
11、含量,Western blot檢測MDM2半衰期變化及外源性核糖體應激下同時沉默PICT-1時MDM2、P53、P21蛋白含量,luciferase assay檢測各個分子信號通路活性,免疫熒光法檢測B23蛋白分布變化及核仁結(jié)構(gòu)改變,免疫熒光法檢測PTEN蛋白在內(nèi)源性沉默PICT-1及外源性核糖體應激下的細胞內(nèi)分布改變。生長曲線及細胞集落形成實驗檢測PICT-1沉默后或外源性核糖體應激下同時沉默PICT-1后細胞增殖生長能力,并計數(shù)行定
12、量統(tǒng)計學分析,流式細胞學用于細胞周期分析;劃痕實驗用于PICT-1沉默后癌細胞侵襲性比較。
結(jié)果:PICT-1沉默特異性高,其造成的細胞生長抑制效果可被鼠源PICT-1表達后所“挽救”。與sh GFP陰性對照比較,PICT-1沉默組:使B23蛋白彌散分布于細胞核,且核仁結(jié)構(gòu)完整性受到破壞;luciferase assay顯示P53信號通路被激活;P53及PTENmRNA無明顯變化;P53、MDM2、P21、磷酸化AKT蛋白
13、上調(diào),PTEN及B23蛋白下調(diào);MDM2蛋白半衰期從0.5小時延長為2小時;與sh GFP陰性對照組比較,PICT-1沉默使細胞生長減慢,集落形成能力下降(P<0.05或P<0.01),細胞周期部分阻滯于G0/G1期;但劃痕實驗顯示細胞的侵襲能力卻增強;在外源性核糖體應激作用下,沉默PICT-1后細胞生長快于陰性對照(P<0.05或P<0.01)。
結(jié)論:
(1) PICT-1沉默破壞了核仁結(jié)構(gòu),引起內(nèi)源性核
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