HBx聯(lián)合AFB1誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)化為肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：轉(zhuǎn)HBx基因大鼠卵圓細(xì)胞株的建立及鑒定
　　 第一節(jié)、真核表達(dá)質(zhì)粒pEGF-HBx構(gòu)建和鑒定
　　 目的:構(gòu)建帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGF-HBx，以利于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的標(biāo)記和觀察，為進(jìn)一步研究HBx基因在卵圓細(xì)胞中的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:用PCR方法從質(zhì)粒pcDNA3.1-HBx中擴(kuò)增含KpnⅠ和Hind Ⅲ限制性酶切位點(diǎn)的HBx基因序

2、列。對(duì)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒載體pEGFP-N1及擴(kuò)增的HBx目的基因片段進(jìn)行雙酶切，純化后用連接酶連接得到重組質(zhì)粒pEGFP-HBx，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、涂皿于培養(yǎng)板，卡那霉素篩選培養(yǎng)得到陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用雙酶切和基因測(cè)序鑒定分析質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。
　　 結(jié)果:雙酶切后電泳，顯示構(gòu)建的pEGFP-HBx質(zhì)粒中含有完整HBx基因大?。?65kb）的片段，基因測(cè)序顯示插入的目的基因連接位點(diǎn)和閱讀框架正確，插入序

3、列為完整的HBx基因，說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建帶熒光的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-HBx，為轉(zhuǎn)染肝卵圓細(xì)胞和進(jìn)一步研究HBx基因在卵圓細(xì)胞中的作用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 第二節(jié)、轉(zhuǎn)HBx基因大鼠卵圓細(xì)胞株的建立及鑒定
　　 目的:建立穩(wěn)定、高效表達(dá)HBx基因的大鼠肝卵圓細(xì)胞株，以便進(jìn)一步研究HBx基因和卵圓細(xì)胞在肝癌發(fā)生過(guò)程中的作用和機(jī)制。
　　 方法:通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法將前面構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒

4、pEGFP-HBx轉(zhuǎn)染大鼠卵圓細(xì)胞 (LE/6)，經(jīng)G418篩選，傳代培養(yǎng)后得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP-HBx融合蛋白的抗性克隆。分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）技術(shù)檢測(cè)抗性克隆中HBx基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
　　 結(jié)果:經(jīng)過(guò)一個(gè)月左右的篩選培養(yǎng)，獲得了穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的卵圓細(xì)胞株；細(xì)胞克隆傳代培養(yǎng)20代后仍表達(dá)強(qiáng)的熒光。RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)HBx基因在抗性細(xì)胞中得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄和翻譯。

5、
　　 結(jié)論:pEGFP-HBx質(zhì)粒能成功地轉(zhuǎn)染卵圓細(xì)胞，并在細(xì)胞中得到有效復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。實(shí)驗(yàn)獲得了穩(wěn)定、高效表達(dá)EGFP-HBx融合蛋白的大鼠卵圓細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)HBx基因卵圓細(xì)胞在肝癌發(fā)生過(guò)程中的作用和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：HBx聯(lián)合AFB1誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為肝癌的實(shí)驗(yàn)研究
　　 第一節(jié)、HBx聯(lián)合AFB1誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化為肝癌的研究
　　 目的:（AFB1）是

6、否能誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞異常轉(zhuǎn)化為肝癌，為明確肝癌是否起源于肝卵圓細(xì)胞找到直接證據(jù)。
　　 方法:在使用AFB1作為誘癌劑的情況下，分別將轉(zhuǎn)染pEGFP-HBx、pEGFP-N1質(zhì)粒的大鼠肝卵圓細(xì)胞種植于裸鼠肝實(shí)質(zhì)內(nèi)和皮下，觀察種植細(xì)胞成瘤情況及性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)分為五組：A組：24只，肝內(nèi)和皮下均種植轉(zhuǎn)HBx基因的卵圓細(xì)胞，同時(shí)喂食AFB1；B組：20只，肝內(nèi)和皮下種植轉(zhuǎn)HBx基因的卵圓細(xì)胞，不喂食AFB1；C組：20只，肝內(nèi)和皮下均種植轉(zhuǎn)

7、pEGFP卵圓細(xì)胞，同時(shí)喂食AFB1；D組：20只，肝內(nèi)和皮下種植轉(zhuǎn)pEGFP卵圓細(xì)胞組，不喂食AFB1；E組：15只，肝內(nèi)和皮下均不注射細(xì)胞，單純喂食AFB1。用透射電子顯微鏡和HE染色進(jìn)行檢查；并用免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤中HBx、OV6、HepParl、CK8、CK7、PCK、Vimentin、SMA、AFP、C-myc和TGF-α的表達(dá)情況，明確其性質(zhì)。
　　 結(jié)果：16周時(shí)，各組皮下成瘤情況為：A組（10/24例）、B組（

8、8/20例）、C組（10/20例）、D組（9/20例）和E組（0/15例）；肝內(nèi)成瘤情況：只有A組（4/24例）在肝內(nèi)形成腫瘤，其于各組均為0。皮下腫瘤由間質(zhì)細(xì)胞組成，表達(dá)OV6、Vimentin和SMA；兩種細(xì)胞（p-HBx和pEGFP）形成的皮下腫瘤性質(zhì)相似；透射電鏡檢查證實(shí)皮下腫瘤為不同程度分化的間質(zhì)瘤。肝內(nèi)腫瘤由間質(zhì)性細(xì)胞和少數(shù)異型性上皮樣細(xì)胞（癌細(xì)胞）組成，后者表達(dá)HBx、OV6、HepPar1、CK7、CK8、PCK、AFP

9、、C-myc和TGF-α抗原；透射電鏡檢查發(fā)現(xiàn)這些異型性上皮樣細(xì)胞為癌細(xì)胞。因而說(shuō)明肝內(nèi)腫瘤為惡性間質(zhì)細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌組成的混合體（肝癌肉瘤）。
　　 結(jié)論：卵圓細(xì)胞可在皮下形成間質(zhì)腫瘤，只有HBx基因和AFB1共同作用才能使肝卵圓細(xì)胞在肝內(nèi)異常轉(zhuǎn)化成肝癌，證明肝癌很可能直接起源于卵圓細(xì)胞的異常轉(zhuǎn)化。
　　 第二節(jié)、EMT和MET在肝卵圓細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肝癌過(guò)程中的作用
　　 目的：研究肝卵圓細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)化成肝癌的機(jī)制，

10、探討上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)和間質(zhì)細(xì)胞-上皮轉(zhuǎn)變(MET)在這一轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用。
　　 方法：在使用AFB1作為誘癌劑的情況下，將轉(zhuǎn)染HBx基因的大鼠肝卵圓細(xì)胞種植于裸鼠皮下，形成皮下腫瘤后再將其移植至肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，使其繼續(xù)生長(zhǎng)，觀察成瘤情況和組織學(xué)差異。分組為：A組 24只，皮下種植轉(zhuǎn)染pEGFP-HBx質(zhì)粒卵圓細(xì)胞；B組 20只，皮下種植轉(zhuǎn)pEGFP-N1質(zhì)粒的卵圓細(xì)胞。10周后，選擇A組皮下腫瘤10例和B組皮下腫瘤8例，

11、移植至同一裸鼠肝實(shí)質(zhì)內(nèi)使其繼續(xù)生長(zhǎng)，分組為：C組 10只，肝內(nèi)種植A組（來(lái)源于轉(zhuǎn)染HBx細(xì)胞）形成的皮下瘤；D組 8只，肝內(nèi)種植B組（來(lái)源于未轉(zhuǎn)染HBx細(xì)胞）形成的皮下瘤。繼續(xù)喂食AFB1，觀察8周。收集皮下腫瘤和肝內(nèi)腫瘤，進(jìn)行HE和透射電鏡檢查，明確腫瘤性質(zhì)；同時(shí)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)皮下腫瘤和肝內(nèi)腫瘤中EMT相關(guān)標(biāo)志物CK8、PCK、Vimentin、SMA、E-cadherin和β-catenin的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：卵

12、圓細(xì)胞種植于皮下后形成完全由間質(zhì)細(xì)胞組成的間質(zhì)瘤（A和B組），其強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)Vimentin和SMA，但無(wú)E-cadherin和CK表達(dá)，表明其發(fā)生了EMT。皮下腫瘤移植至肝實(shí)質(zhì)后，可繼續(xù)生長(zhǎng)：來(lái)源于轉(zhuǎn)HBx細(xì)胞的肝內(nèi)腫瘤（C組）由占大多數(shù)的間質(zhì)瘤細(xì)胞和少數(shù)肝癌細(xì)胞混雜而成，為肝內(nèi)癌肉瘤，癌細(xì)胞表達(dá)HBx、HepPar1、CK8、PCK、E-cadherin和β-catenin抗原，而間質(zhì)瘤細(xì)胞中Vimentin和SMA表達(dá)下降，表明發(fā)生