Vasostatin-1基因轉(zhuǎn)染抗心肌缺血-再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：⑴構(gòu)建和鑒定攜帶人嗜鉻粒蛋白A的N端1-76片段(CGA1-76)即Vasostatin-1(VS-1)基因的重組腺病毒表達(dá)載體，繼而觀察其轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞后的VS-1蛋白表達(dá)。⑵建立原代大鼠心肌細(xì)胞和大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(RAECs)培養(yǎng)的缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷模型模擬體內(nèi)缺血/再灌注損傷(MIRI)，觀察Ad-VS-1基因轉(zhuǎn)染抗心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷的作用。⑶構(gòu)建大鼠心肌細(xì)胞和RAECs的H/R損傷模型模擬體內(nèi)MIR

2、I，系統(tǒng)探討Ad-VS-1基因轉(zhuǎn)染抗心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血/再灌注損傷作用的機(jī)制和通路。⑷建立大鼠心肌細(xì)胞—血管內(nèi)皮細(xì)胞的Transwell微孔滲透共培養(yǎng)模型模擬體內(nèi)心肌細(xì)胞/血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)-功能關(guān)聯(lián)，建立H/R損傷模型模擬MIRI，探討共培養(yǎng)中VS-1基因轉(zhuǎn)染的心肌保護(hù)作用和由內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的心肌保護(hù)機(jī)制。 方法：①利用CGA1-58cDNA模版，設(shè)計(jì)引物，PCR合成、擴(kuò)增CGA1-76cDNA并將其克隆至穿梭質(zhì)粒pAd-

3、Track中，經(jīng)Pme I酶切線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸埃希菌BJ5183中同源重組。經(jīng)PCR、基因測(cè)序、酶切鑒定正確的同源重組質(zhì)粒pAd-VS-1經(jīng)Pac I酶切線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝、擴(kuò)增得到重組腺病毒顆粒Ad-VS-1。②將Ad-VS-1轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞并通過(guò)Western免疫印跡法檢測(cè)VS-1的蛋白表達(dá)。③.分別進(jìn)行大鼠心肌細(xì)胞和大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(RAECs)的分離純化，并建立各自的H/R模型。④

4、建立大鼠原代心肌細(xì)胞和RAECs的H/R損傷模型，分設(shè)：空白組，H/R組，空載腺病毒轉(zhuǎn)染+H/R組，Ad-VS-1轉(zhuǎn)染+H/R組。⑤構(gòu)建大鼠心肌細(xì)胞—RAECs微孔滲透Transwell共培養(yǎng)的H/R模型，同期構(gòu)建單純心肌細(xì)胞培養(yǎng)的H/R模型為對(duì)照列。 結(jié)果：⑴鑒定證實(shí)VS-1基因重組質(zhì)粒pAd-VS-1構(gòu)建成功，將其導(dǎo)入293細(xì)胞包裝、擴(kuò)增得到VS-1基因重組腺病毒Ad-VS-1。⑵Western印跡法證實(shí)Ad-VS-1轉(zhuǎn)染心

5、肌細(xì)胞并表達(dá)VS-1蛋白。⑶同空白對(duì)照組相比，H/R損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞活力顯著降低。⑷H/R損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞膜通透性增加，SOD含量、eNOS、NO、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，MDA含量、ICAM-1、VCAM-1、TNF-a、NF-kB和Bax等細(xì)胞因子和蛋白表達(dá)顯著增加。⑸同單純心肌細(xì)胞培養(yǎng)的空載腺病毒轉(zhuǎn)染組的H/R損傷相比，共培養(yǎng)的相應(yīng)組中的心肌細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞凋亡率和心肌酶譜(AS

6、T， CK-MB)顯著升高。 結(jié)論：①成功構(gòu)建Ad-VS-1重組腺病毒，并證實(shí)其能有效轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)VS-1蛋白。②VS-1基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)在心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的抗H/R損傷作用。③Ad-VS-1基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)的VS-1通過(guò)抑制氧自由基損傷、炎癥因子和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)NO保護(hù)作用以及PI3K/Akt，eNOS-NO-cGMP-PKG和P38MPAK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，產(chǎn)生預(yù)防細(xì)胞H/R損傷的心肌保護(hù)作用。④在共培養(yǎng)