質(zhì)粒輔助2型重組腺相關病毒的制備及其針對腦缺血和膠質(zhì)細胞瘤基因治療的改建.pdf

1、基因治療首要的關鍵技術是如何將目的基因輸送并進入到特定的靶細胞,使之高效的表達外源基因,因而對基因治療載體的選擇一直是困擾基因治療深入研究的難題.自七十年代末提出病毒載體的概念以來,應用于基因治療研究的缺陷性病毒載體種類越來越多,應用也越來越廣泛.但是,單純皰疹病毒載體的神經(jīng)毒性,腺病毒載體的免疫原性和逆轉(zhuǎn)錄病毒隨機整合的致癌性均限制了它們在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應用.RAAV載體以其安全性好、宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高等幾方面的突出優(yōu)勢而倍

2、受關注,是目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的良好載體.但是,rAAV制備困難,是目前阻礙以rAAV為載體進行基因治療研究的難題之一.現(xiàn)在所采用的rAAV的制備方法操作復雜,對設備要求高,在普通實驗室難以完成.如何優(yōu)化一種簡便易行,對實驗條件要求不高,可滿足動物實驗的需要,在普通實驗室就可以完成的rAAV的重組和純化方案對rAAV為載體的基因治療的研究有重要的推動作用.此外,通用型的rAAV并不能很好的滿足缺血性腦血管病和腦膠質(zhì)細胞瘤基因治療的需

3、要.通用型CMV啟動子的腺相關病毒載體長期表達目的基因,對腦缺血進行基因治療時會導致血管過度增生和促進潛在腫瘤生長,在基因治療的安全性方面存在一定的缺陷,如果改進病毒載體啟動子,使目的基因僅在腦缺血時表達,就可以在安全性方面取得更加良好的效果.而在腦膠質(zhì)細胞瘤治療方面:神經(jīng)元對rAAV的親和能力比膠質(zhì)細胞強,因此對于毒性基因治療膠質(zhì)細胞腫瘤必須采用膠質(zhì)細胞特異性表達的rAAV,來實現(xiàn)毒性基因的選擇性表達.基于以上原因,該課題對質(zhì)粒輔助2

4、型重組腺相關病毒的制備及其針對腦缺血和膠質(zhì)細胞瘤基因治療的改建進行了研究.質(zhì)粒輔助2型重組腺相關病毒制備方法的優(yōu)化:該研究采用質(zhì)粒輔助腺相關病毒重組系統(tǒng),通過磷酸鈣質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法,在HEK293T細胞內(nèi)合成rAAV,通過氯仿-PEG8000/NaCl-氯仿法接合超濾純化rAAV病毒.通過蛋白電泳和Western雜交檢測病毒外鞘蛋白,斑點雜交和病毒轉(zhuǎn)染檢測病毒的物理和生物滴度證實優(yōu)化后的該方法可以獲得高滴度的rAAV,可滿足小動物實驗的

5、需要,對儀器設備要求不高,在普通實驗室均可完成.低氧啟動rAAV的構(gòu)建:通過酶切連接和PCR等分子生物學技術應用6×HRE CMVmp低氧啟動子代替CMW啟動子構(gòu)建了pAAV-6×HRE CMV-mp質(zhì)粒,通過優(yōu)化的病毒重組和純化方法制備了低氧啟動rAAV-VEGF病毒.體外細胞實驗研究證實:低氧啟動rAAV-VEGF病毒僅在低氧時表達VEGF蛋白,而且隨著低氧時間的延長VEGF表達量增加,同時通過血管通透性試驗證實表達的VEGF165

6、蛋白可以分泌到細胞外,并具有生物活性.低氧啟動rAAV-VEGF165的構(gòu)建,為缺血性腦血管病的基因治療提供了安全的基因治療載體.膠質(zhì)細胞特異性rAAV的構(gòu)建:通過酶切連接和PCR等分子生物學技術采用6×HRE-GFAP膠質(zhì)細胞特異性啟動子代替CMV啟動子構(gòu)建了pAAV-6×HRE GFAP質(zhì)粒,通過優(yōu)化的病毒重組和純化方法制備了膠質(zhì)細胞特異性rAAV-VEGF病毒.采用膠質(zhì)細胞啟動子后,病毒的包裝在ITR和Rep蛋白的調(diào)控下進行,不表