內(nèi)源性FGF23對PTH促成骨細胞分化作用的影響.pdf

1、目的:
　　甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)的促成骨作用是其治療骨質(zhì)疏松癥的重要藥理基礎，然而對其促進成骨細胞分化的細胞基礎和影響因素等尚存爭議，其作用機制也未完全闡明。PTH有調(diào)節(jié)成纖維生長因子(fibroblast growthfactor, FGF)23表達的作用，而FGF23對成骨細胞分化和基質(zhì)礦化具有直接影響。細胞FGF23表達是否影響PTH的促成骨細胞分化作用等尚不明確。為此，本文利用體外

2、培養(yǎng)大鼠成骨細胞，在觀察rhPTH1-34促成骨細胞分化的基礎上，采用RNA干擾技術沉默其FGF23的表達，研究內(nèi)源性FGF23對PTH促分化作用的影響。
　　方法:
　　1.采用酶消化法分離培養(yǎng)新生SD大鼠頭蓋骨成骨細胞，應用堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)染色和體外礦化結節(jié)茜素紅(Alizarin Redstaining，ARS)染色進行成骨細胞功能學鑒定。
　　2.為觀察PTH對成骨

3、細胞分化的作用，本文以重組人甲狀旁腺激素（recombinant human parathyroid hormone，rhPTH）1-34間隙循環(huán)加入作用3d，應用PNPP法和MTT法檢測體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞總堿性磷酸酶(ALP)活性和細胞增殖率，分別以OD405nm/孔和OD570nm/孔表示，并以OD405nm/OD570nm計算細胞ALP比活性。為進一步觀察rhPTH1-34對成骨細胞分化的時效作用，以10-9 mol/L rhP

4、TH1-34一次性給予后，分別于2h、8h和24 h連續(xù)取樣，應用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術分析成骨細胞ALP和骨鈣素(OCN) mRNA水平變化。
　　3.為明確PTH對成骨細胞FGF23表達的作用，本文采用10-9 mol/L rhPTH1-34一次性給予后，分別于2h、8h和24 h連續(xù)取樣，應用Real-time PCR技術觀察細胞FGF23轉錄水平變化。進一步以10-9 mol/L rhPTH1

5、-34作用3d后，收獲細胞應用Western blot技術檢測胞內(nèi)FGF23蛋白水平。
　　4.為研究內(nèi)源性FGF23在PTH促成骨細胞分化中的作用，本文采用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術，以大鼠成骨細胞FGF23 mRNA213～235位點為靶序列設計小發(fā)夾RNA(FGF23i-shRNA)，以慢病毒載體pLKO.1為骨架，構建重組載體。采用脂質(zhì)體法轉染沉默大鼠成骨細胞FGF23表達后，以10-9

6、mol/L rhPTH1-34作用2h，取細胞應用Real-time PCR分析其FGF23、ALP和OCN mRNA水平。
　　結果:
　　1.PTH對體外培養(yǎng)成骨細胞分化具有一定刺激作用。PNPP法檢測結果顯示，10-12～10-8 mol/L rhPTH1-34間隙循環(huán)作用3d細胞總ALP活性增加14.8％～40％(P＜0.05～P＜0.001)，以10-9 mol/L濃度作用最明顯。MTT法測定結果顯示，10-10～

7、10-8 mol/L rhPTH1-34間隙循環(huán)作用3d細胞增殖率增加31.6％～50.5％(P＜0.05～P＜0.001)。細胞ALP比活性(OD405nm/OD570nm)在2.1～2.4之間波動，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。Real-time PCR結果顯示，10-9 mol/LrhPTH1-34作用2h時細胞ALP mRNA水平增加35％(P＜0.05)，8h和24 h時逐漸恢復;OCN mRNA水平在2h時有增加趨勢（16％

8、，P＞0.05），8h時增加幅度加大至80％(P＜0.05)，24 h時恢復。
　　2.PTH上調(diào)體外培養(yǎng)成骨細胞FGF23表達。 Real-time PCR結果顯示，10-9mol/L rhPTH1-34作用2h時細胞FGF23 mRNA水平增加4倍(P＜0.001)，8h時增加67％(P＜0.05)，24 h時恢復。Westem blot分析結果顯示，10-9 mol/LrhPTH1-34作用3d細胞FGF23蛋白表達有增加趨

9、勢(41％)，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.FGF23基因沉默后PTH促成骨細胞分化作用明顯增強。Real-time PCR結果顯示，10-9 mol/L rhPTH1-34作用2h，F(xiàn)GF23沉默(FGF23i-shRNA)細胞FGF23表達無上調(diào)，而其ALP和OCN表達明顯上調(diào)，其轉錄水平分別增加1.8倍(P＜0.05）和5.8倍（P＜0.01），明顯高于空載體轉染細胞的43.5％(P＜0.05)和25.5％(