成骨細(xì)胞FGF23的表達(dá)與局部調(diào)節(jié)研究.pdf

1、目的:
　　通過體外培養(yǎng)新生大鼠頭蓋骨細(xì)胞,研究成骨細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23(Fibroblastgrowthfactor23,FGF23)表達(dá)及鈣、磷、甲狀旁腺激素(parathyroidhormone,PTH)和1,25二羥維生素D(1,25(OH)2D3)對(duì)其表達(dá)的影響;研究FGF23表達(dá)水平與成骨細(xì)胞分化狀態(tài)的關(guān)系,并從1,25(OH)2D旁分泌/自分泌和細(xì)胞接觸通訊的角度研究其分化過程中高表達(dá)的局部調(diào)節(jié)機(jī)制。

2、　　方法:
　　1.體外分離培養(yǎng)新生大鼠頭蓋骨細(xì)胞,應(yīng)用堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)、茜素紅(Alizarinbordeauxstaining,ARS)染色等方法進(jìn)行成骨細(xì)胞功能學(xué)鑒定。采用RT-PCR和蛋白印記(Westernblot)方法檢測(cè)FGF23在成骨細(xì)胞中的表達(dá)及鈣(5mmol/L氯化鈣)、磷(5mmol/L,β甘油磷酸鈉,β-GP)、PTH(10-9mol/LrhPTH(1-34))和

3、1,25(OH)2D3(10-8M)的作用;
　　2.分別于成骨細(xì)胞半?yún)R合、匯合、基質(zhì)堆積、礦化四個(gè)培養(yǎng)階段獲得不同分化狀態(tài)細(xì)胞,通過其ALP、骨鈣素(Osteocalcin,OCN)和骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)的mRNA表達(dá)水平變化進(jìn)行分化狀態(tài)驗(yàn)證。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR)和Westernblot技術(shù)檢測(cè)其FGF23mRNA和細(xì)胞內(nèi)FGF23蛋白水平的變化。
　　3.分別檢測(cè)成骨細(xì)

4、胞于增殖狀態(tài)(半?yún)R合)和分化狀態(tài)(匯合階段)的1α-羥化酶基因CYP2781和24-羥化酶基因CYP24A的mRNA表達(dá)水平,并通過1α-羥化酶底物25(OH)D3和羥化酶抑制劑酮康唑(Ketoconazole,KET)作用,觀察無(wú)血清培養(yǎng)條件下成骨細(xì)胞內(nèi)源性1,25(OH)2D對(duì)FGF23表達(dá)的影響。
　　4.觀察細(xì)胞在100μmol/L縫隙連接蛋白抑制劑甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)對(duì)成骨細(xì)胞匯合前后FGF23表

5、達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞中FGF23的mRNA和蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性。外源性10-8mol/L1,25(OH)2D3刺激后,成骨細(xì)胞FGF23的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào),約為對(duì)照組的16倍(p＜0.001),而CaCl2、β-GP、PTH刺激后FGF23mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞FGF23的表達(dá)呈分化階段性,分化成熟狀態(tài)(匯合階段)細(xì)胞FGF23表達(dá)顯

6、著上調(diào),其mRNA為半?yún)R合的增殖狀態(tài)細(xì)胞的7.5倍(p＜0.001),蛋白水平為增殖狀態(tài)細(xì)胞的126％?；|(zhì)堆積和礦化階段,FGF23mRNA回落至半?yún)R合水平,而其蛋白水平逐漸累及,基質(zhì)堆積期蛋白水平為增殖時(shí)期的207％(p＜0.05)。與增殖狀態(tài)細(xì)胞比較,分化狀態(tài)成骨細(xì)胞CYP27B1(編碼1α羥化酶)和CYP24A(編碼24羥化酶)表達(dá)上調(diào),其mRNA水平分別為增殖狀態(tài)的2倍(p＜0.05)和34倍(p＜0.001),提示內(nèi)源性1,

7、25(OH)2D功能的增強(qiáng)。
　　3.無(wú)血清培養(yǎng)時(shí),在半?yún)R合和匯合階段加入100nmol/L25(OH)D3,明顯上調(diào)成骨細(xì)胞FGF23表達(dá),其mRNA水平分別為對(duì)照組的16倍(p＜0.001)和28倍(p＜0.001)。對(duì)匯合階段細(xì)胞的刺激作用強(qiáng)于半?yún)R合階段。同時(shí)CYP2781表達(dá)增加(p＜0.05),CYP24A表達(dá)顯著增加,匯合前和匯合狀態(tài)成骨細(xì)胞CYP24AmRNA水平分別為對(duì)照組的1700倍(p＜0.001)和800倍(

8、p＜0.001)。10nmol/L羥化酶抑制劑KFT可有效阻斷該底物的刺激作用。
　　4.100μmol/L甘珀酸明顯抑制無(wú)血清培養(yǎng)中匯合階段成骨細(xì)胞FGF23表達(dá),其mRNA水平較PBS對(duì)照組減少38％(p＜0.05),半?yún)R合階段細(xì)胞的抑制作用不明顯。
　　結(jié)論:
　　1.外源性1,25(OH)2D能強(qiáng)烈刺激體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞FGF23的表達(dá)。
　　2.生理狀態(tài)下FGF23的表達(dá)與成骨細(xì)胞的分化狀態(tài)有關(guān),分化成熟