2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:
   CSN6是近幾年受到關(guān)注的致癌蛋白,在細胞周期及細胞凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,其在乳腺癌、甲狀腺癌、肺癌等多種腫瘤中高表達,和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。CSN6的主要功能為通過調(diào)控蛋白質(zhì)的泛素化而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,從而影響蛋白質(zhì)的功能。文獻報道,CSN6對MDM2-p53軸及COP1-14-3-3σ軸有重要的調(diào)節(jié)作用,并由此促進腫瘤的發(fā)生。人體內(nèi)CSN6的蛋白水平和腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系,但其上游分子目前尚不清楚。A

2、kt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,為人體內(nèi)重要的腫瘤調(diào)節(jié)因子,對多種下游分子起調(diào)節(jié)作用,其在EGF、IGF等生長因子傳導通路上發(fā)揮重要作用,與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。盡管目前對Akt的研究頗多,但對其下游分子并未完全了解。Akt與CSN6同為細胞周期、MDM2-p53軸和DNA損傷反應的調(diào)節(jié)因子,但兩者的關(guān)系目前尚不清楚,既往有研究提示Akt可能對CSN某些亞復合體有調(diào)節(jié)作用,但具體哪個亞單位,并不清楚。我們用NetPhos algorithm(

3、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)系統(tǒng)比對出CSN6具有Akt激酶的磷酸化模序,因此推測Akt可磷酸化CSN6,但此尚需要大量的實驗來證實。
   研究目的:
   1.探討Akt激酶是否對CSN6蛋白水平有調(diào)節(jié)作用。
   2.探討Akt激酶對CSN6水平調(diào)節(jié)的機制。
   3.探討Akt-CSN6軸對非小細胞肺癌(NSCLC)惡性生長的影響。
  

4、 材料及方法:
   1.Akt激酶過表達對外源性CSN6水平的影響
   對293T細胞,共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及不同濃度的HA-Akt質(zhì)粒,48小時后對細胞進行GFP熒光檢測及收集蛋白進行Western Blot實驗。
   2.Akt激酶過表達對內(nèi)源性CSN6水平的影響
   選擇Rat-1細胞,建立Akt穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株(Rat-1 Akt細胞株)及空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株(Rat-1細胞株),收集蛋白

5、,進行Western Blot,比較兩組細胞CSN6蛋白的含量。
   3.抑制Akt激酶活性對CSN6水平的影響
   選擇MDA-MB453細胞,建立陽性負調(diào)節(jié)突變型Akt(Dominant Negative Akt,DN-Akt)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株(MDA-MB453 DN-Akt細胞株)及空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株(MDA-MB453),收集蛋白,進行Western Blot,比較兩組細胞CSN6蛋白的含量。對293T細胞

6、,共轉(zhuǎn)染Flag-CSN6及HA-Akt質(zhì)粒,同時用PI3K抑制劑LY294002(終濃度50μM)處理細胞,6小時后,檢測CSN6蛋白含量,比較用藥組及對照組CSN6蛋白的水平。
   4.Akt激酶對CSN6核轉(zhuǎn)位的影響
   對U20S細胞,共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及HA-Akt質(zhì)粒,72小時后,用免疫熒光實驗檢測GFP-CSN6亞細胞內(nèi)分布情況。同樣方法,觀察Rat-1-Akt細胞CSN6亞細胞分布情況。
 

7、  5.Akt激酶對CSN6蛋白降解率的影響
   對293T細胞,共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6和HA-Akt質(zhì)粒,24小時后,加蛋白合成抑制劑放線菌酮(CHX)(終濃度60μg/ml)培養(yǎng),分別于加藥后1、2及4小時,收集細胞,進行Western Blot,檢測CSN6蛋白含量。用Image J軟件計算CSN6蛋白降解率。
   6.Akt激酶對CSN6泛素化的影響
   對293T細胞,共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6、H

8、A-ubiquitin及不同濃度的HA-Akt質(zhì)粒,6小時后加入蛋白酶體抑制劑MG132培養(yǎng),轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞,提取蛋白,每組取1g蛋白(500μl蛋白提取物)用抗GFP抗體進行免疫沉淀(immunoprecipitation,IP),用抗泛素抗體對免疫沉淀物進行Western Blot,以測定CSN6泛素化水平。
   7.Akt激酶與CSN6蛋白的結(jié)合
   構(gòu)建Flag-CSN6-全長片段(Full-leng

9、th CSN6)、Flag-CSN6-N端片段(氨基酸41-171)(N terminus ofCSN6)及Flag-CSN6-C端片段(氨基酸194-321)(C-terminus ofCSN6)質(zhì)粒,將3種片段的質(zhì)粒分別與HA-Akt質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,48小時后,收集細胞,每組細胞取2g蛋白(500μl蛋白提取物)進行免疫共沉淀,用抗-Flag抗體進行免疫沉淀,用抗HA抗體對免疫沉淀物進行WesternBlot,檢測Akt激酶

10、和CSN6蛋白的結(jié)合狀態(tài)。
   8.Akt激酶磷酸化CSN6
   構(gòu)建能在大腸桿菌中高表達蛋白的pET-Flag-CSN6-WT及pET-Flag-CSN6-S60A質(zhì)粒,提取Flag-CSN6-WT及Flag-CSN6-S60A重組蛋白,配制激酶反應體系,用同位素法進行Akt激酶體外激酶活性測定,檢測加入Akt激酶后各組CSN632P的放射活性。
   9.Serine60突變后Akt激酶對CSN6水平、降

11、解率及泛素化的影響
   (1)構(gòu)建myc-CSN6野生型質(zhì)粒,并用QuickChange定點突變系統(tǒng)獲得myc-CSN6 S60A突變型和myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒。
   (2)對293T細胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型和myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒,48小時后收集蛋白,進行WesternBlot,檢測各組CSN6含量。
   (3)對29

12、3T細胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒,24小時后加入Cycloheximide(終濃度60μg/ml)培養(yǎng),分別于處理后1、2、4小時,收集細胞,進行Western Blot,檢測CSN6蛋白降解率。
   (4)對293T細胞,共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Ak

13、t質(zhì)粒,6小時后加入蛋白酶體抑制劑MG132,轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞,用抗myc抗體進行免疫沉淀,用抗泛素抗體對免疫沉淀物進行Western Blot,以測定CSN6泛素化水平。
   10.Akt激酶對CSN6轉(zhuǎn)錄水平的影響
   對293T細胞共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及不同濃度的HA-Akt質(zhì)粒,48小時后收集RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR),測定CSN6mRNA水平,以GAPDH作為

14、內(nèi)參,用相對定量法的2-△△CT值比較組間表達的差異。
   11.Akt激酶對CSN6介導的MDM2及p53降解的影響
   對非小細胞肺癌A549細胞,共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒,48小時后收集蛋白用抗-MDM2及抗p53抗體進行Western Blot,檢測MDM2及p53蛋白水平。
   12.Akt激酶對CSN6

15、介導的NSCLC細胞DNA損傷的影響
   對HCT116細胞,轉(zhuǎn)染野生型CSN6,測定細胞內(nèi)反應氧自由基(ROS)及7-H2AX水平變化,此外,在轉(zhuǎn)染的同時加入LY294002處理,重復上述測定。
   13.Akt激酶對CSN6介導的NSCLC細胞增殖能力的影響
   對非小細胞肺癌A549細胞,共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt

16、質(zhì)粒,24小時后,將細胞分別接種到6孔及96孔板,分別進行MTS實驗、平板集落形成實驗及軟瓊脂非錨定依賴性克隆形成實驗,檢測Akt激酶對CSN6介導的NSCLC細胞惡性生長能力的影響。
   14.肺癌組織Akt激酶與CSN6蛋白表達的相關(guān)性
   選擇非小細胞肺癌患者肺癌組織芯片,兩張芯片共有40例配對的肺癌組織,用免疫組化LSA法分別檢測CSN6及P-Akt(473)表達水平,使用H-score半定量法判定信號的強弱

17、,分析CSN6與P-Akt(473)蛋白水平的相關(guān)性。
   實驗結(jié)果
   1.Akt激酶對CSN6水平的影響
   (1)Akt激酶過表達上調(diào)外源性CSN6水平:293T細胞,共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及不同濃度的HA-Akt質(zhì)粒后,Western Blot及GFP熒光檢測均顯示加入Akt后,293T細胞內(nèi)CSN6水平明顯增加,且隨著Akt濃度的升高而逐漸增加。
   (2)Akt激酶過表達上調(diào)內(nèi)源性CS

18、N6水平:高表達AKT的Rat-1 Akt細胞穩(wěn)定株(Rat-1-Akt)CSN6水平明顯高于對照組Rat-1細胞株的CSN6含量。
   (3)抑制Akt激酶活性下調(diào)CSN6水平:MDA-MB453-DN-Akt細胞CSN6水平明顯低于對照組MDA-MB453細胞株。293T細胞受PI3K抑制劑LY294002處理后,CSN6水平明顯降低。
   (4)肺癌組織Akt激酶與CSN6蛋白的表達相關(guān):40例非小細胞肺癌組織

19、中,P-Akt高表達的23例,其中CSN6高表達的為15例(65.22%),低表達的為8例(34.78%);P-AKT低表達的17例,其中CSN6高表達的為5例(29.41%),低表達的為12例(70.58%),經(jīng)卡方檢驗,兩組比較差別有統(tǒng)計學意義,說明CSN6的表達水平與P-Akt(473)的表達水平明顯正相關(guān)。
   2.Akt激酶對CSN6核轉(zhuǎn)位的影響
   U2OS細胞共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及不HA-Akt質(zhì)粒后

20、,免疫熒光檢測顯示加入Akt組CSN6亞細胞分布由細胞漿向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,同樣AKT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Rat-1細胞CSN6亞細胞也分布發(fā)生由漿到核的轉(zhuǎn)移。
   3.Akt激酶對CSN6蛋白降解率的影響
   293T細胞,共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及HA-Akt質(zhì)粒并用并加蛋白合成抑制劑Cycloheximide處理1、2、4小時后,CSN6蛋白降解率測定顯示:轉(zhuǎn)染Akt組CSN6蛋白的降解速度較未轉(zhuǎn)染組明顯減慢,而MDA-MB4

21、53-DN-Akt細胞CSN6蛋白降解速度較未轉(zhuǎn)染組明顯加快,Image J軟件計算結(jié)果顯示0、1、2及4小時CSNA6/Vector組蛋白降解率分別為100%,50%,55%及0,而CSN6/HA-Akt組分別為100%,110%,100%及95%,說明Akt激酶可抑制CSN6蛋白的降解。
   4.Akt激酶對CSN6泛素化的影響
   293T細胞共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6、HA-ubiquitin及不同濃度的HA-A

22、kt質(zhì)粒后,加入Akt組293T細胞內(nèi)CSN6泛素化水平明顯降低,且隨著Akt濃度的增加而降低更明顯。說明Akt激酶可抑制CSN6的泛素化。
   5.Akt激酶與CSN6蛋白的結(jié)合
   293T細胞共轉(zhuǎn)染HA-Akt及Flag-CSN6-全長片段、Flag-CSN6-N端片段及Flag-CSN6-C端片段質(zhì)粒后,免疫共沉淀結(jié)果顯示,Akt激酶和CSN6蛋白直接結(jié)合在一起,而與C端片段相比,與N端片段具有更明顯的結(jié)合能

23、力。
   6.Akt激酶磷酸化CSN6
   同位素體外激酶活性測定結(jié)果顯示加入Akt激酶組的CSN6顯示32P的放射活性,而未加入Akt激酶的CSN6無放射活性,說明Akt激酶可磷酸化CSN6蛋白。
   7.Akt激酶磷酸化CSN6的位點為Serine60
   (1)同位素體外激酶活性測定實驗結(jié)果顯示:加入Akt激酶后,CSN6 S60A突變型組的CSN632P放射活性明顯低于野生型CSN6組,說

24、明CSN6的S60位點是Akt激酶的作用位點之一。
   (2)293T細胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒后,細胞內(nèi)CSN6水平測定結(jié)果顯示:myc-CSN6S60D突變型組CSN6水平明顯增高,myc-CSN6野生型組次之,CSN6 S60A突變型組無明顯改變。
   (3)293T細胞,共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6

25、 S60A突變型及myc-CSN6S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒后,細胞內(nèi)CSN6蛋白降解率測定結(jié)果顯示:myc-CSN6 S60D突變型組CSN6的降解明顯減慢,myc-CSN6野生型組次之,CSN6 S60A突變型組無明顯改變。
   (4)293T細胞,共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒后,CSN6泛素化水平測定結(jié)果顯示:myc-CSN

26、6-S60D突變型組CSN6泛素化水平明顯減低,myc-CSN6野生型組次之,CSN6 S60A突變型組無明顯改變。
   8.Akt激酶對CSN6轉(zhuǎn)錄水平的影響
   293T細胞共轉(zhuǎn)染GFP-CSN6及不同濃度的HA-Akt質(zhì)粒后,結(jié)果顯示加入Akt組293T細胞內(nèi)CSN6 mRNA水平增加,且隨著Akt濃度的增加而逐漸增加,說明Akt激酶對CSN6的轉(zhuǎn)錄也有一定的促進作用。
   9.Akt激酶對CSN6介

27、導的MDM2及p53降解的影響
   A549細胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒后,MDM2及p53水平測定結(jié)果顯示myc-CSN6S60D突變型組MDM2水平明顯增高,myc-CSN6野生型組次之,CSN6 S60A突變型組改變不明顯。myc-CSN6 S60D突變型組p53蛋白水平明顯降低,myc-CSN6野生型組次之,myc-CSN6 S

28、60A突變型組無明顯改變。
   10.Akt激酶對CSN6介導的NSCLC細胞DNA損傷的影響
   HCT116細胞轉(zhuǎn)染野生型CSN6后,γ-H2AX點數(shù)較對照組明顯增加,而當轉(zhuǎn)染的同時加入LY294002后γ-H2AX點數(shù)較對照組明顯減少。
   HCT116細胞轉(zhuǎn)染野生型CSN6后,DCF測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CSN6的細胞ROS形成率明顯較對照組增加,而當轉(zhuǎn)染的同時加入LY294002后ROS形成率較未加LY

29、294002組明顯減少。
   11.Akt激酶提高CSN6介導的NSCLC細胞增殖能力
   非小細胞肺癌A549細胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型及HA-Akt質(zhì)粒后,MTS測定結(jié)果顯示myc-CSN6S60D突變型組細胞增殖率明顯增高,myc-CSN6野生型組次之,CSN6 S60A突變型組無明顯改變,三組間比較差異有統(tǒng)計學意義。說明Akt激酶對CS

30、N6介導的NSCLC細胞增殖能力具有提高作用。
   12.Akt激酶提高CSN6介導的NSCLC細胞平板集落形成能力
   非小細胞肺癌A549細胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Akt質(zhì)粒后,平板集落形成實驗結(jié)果顯示myc-CSN6 S60D突變型組細胞集落形成率明顯增高,myc-CSN6野生型組次之,CSN6 S60A突變型組無明顯改變,三

31、組間比較差異有統(tǒng)計學意義。說明Akt激酶對CSN6介導的NSCLC細胞非密度依賴生長能力具有提高作用。
   13.Akt激酶提高CSN6介導的NSCLC細胞軟瓊脂集落形成能力
   非小細胞肺癌A549細胞共轉(zhuǎn)染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突變型及myc-CSN6 S60D突變型質(zhì)粒及HA-Ala質(zhì)粒后,軟瓊脂非錨定依賴性克隆形成實驗結(jié)果顯示CSN6 S60D突變型組細胞軟瓊脂非錨定克隆形成率明顯

32、增高,CSN6野生型組次之,CSN6 S60A突變型組無明顯改變,三組間比較差異有統(tǒng)計學意義。說明Akt激酶對CSN6介導的NSCLC細胞非錨定依賴性生長能力具有提高作用。
   結(jié)論:
   1.Akt激酶抑制CSN6的降解,上調(diào)CSN6水平。
   2.Akt激酶抑制CSN6降解的機制為,Akt激酶與CSN6結(jié)合,磷酸化CSN6,使CSN6的泛素化降低。
   3.Akt激酶磷酸化CSN6的位點為Se

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