體外成熟卵母細(xì)胞線粒體和紡錘體的功能和形態(tài)變化研究.pdf

1、卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation，IVM)培養(yǎng)技術(shù)在自然周期或使用少量促性腺激素的周期，將不成熟的卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)成熟，進(jìn)行體外受精和胚胎移植，它克服了促排卵藥物的副作用，是今后助孕技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)之一。卵母細(xì)胞能在體外成熟和受精，并且胚胎移植后可成功妊娠，但體外成熟率和受精率低，胚胎發(fā)育阻滯率高，囊胚形成率及妊娠率低。這提示體外成熟的卵母細(xì)胞存在著細(xì)胞質(zhì)成熟欠缺或核漿成熟不協(xié)調(diào)的問題，這是目前制約IVM技術(shù)廣泛

2、應(yīng)用的主要障礙，因此繼續(xù)深入認(rèn)識(shí)卵母細(xì)胞的成熟規(guī)律和改善體外成熟培養(yǎng)環(huán)境是當(dāng)前的主要研究方向。 卵母細(xì)胞內(nèi)在的質(zhì)量是其發(fā)育到優(yōu)質(zhì)胚胎的決定性因素，對(duì)卵母細(xì)胞中線粒體增殖、功能和動(dòng)態(tài)分布的探討有助于對(duì)體外成熟卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育異常的了解。線粒體通過氧化磷酸化合成ATP，是有核細(xì)胞能量的主要來源。足量的ATP是卵母細(xì)胞完成第一次減少分裂的關(guān)鍵因素。線粒體還是卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子活動(dòng)的調(diào)節(jié)和儲(chǔ)存器，在卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中，線

3、粒體動(dòng)態(tài)分布于微管等周圍提供ATP和鈣離子，促進(jìn)胞內(nèi)細(xì)胞器和骨架重組完成。卵胞漿內(nèi)的線粒體對(duì)卵母細(xì)胞成熟、受精及以后胚胎的發(fā)育起著重要的作用。一旦卵母細(xì)胞啟動(dòng)成熟進(jìn)程，線粒體開始聚集在紡錘體和皮質(zhì)層，提供ATP和鈣離子促進(jìn)細(xì)胞骨架和胞漿的運(yùn)動(dòng)。影響線粒體功能和線粒體在卵母細(xì)胞紡錘體周圍聚集的化學(xué)物質(zhì)都可引起減數(shù)分裂停滯、延遲，以及染色體的提前分裂或不分離。紡錘體是卵母細(xì)胞的一個(gè)重要組成部分，在細(xì)胞分裂過程中，紡錘體對(duì)卵母細(xì)胞染色體的平衡

4、、運(yùn)動(dòng)、分配和極體的排出有非常重要的作用。紡錘體異常，會(huì)導(dǎo)致異常的減數(shù)分裂，有可能產(chǎn)生異常的胚胎。它的形態(tài)學(xué)變化可能反映了體外培養(yǎng)環(huán)境中卵母細(xì)胞的質(zhì)量。Polscope利用細(xì)胞內(nèi)大分子結(jié)構(gòu)的雙折射性，將光學(xué)硬件和數(shù)字傳導(dǎo)結(jié)合起來使紡錘體成像。目前Polscope已用來研究鼠和人的卵母細(xì)胞，其獲取的紡錘體結(jié)構(gòu)信息與傳統(tǒng)固定和熒光免疫方法有高度一致性，對(duì)于卵母細(xì)胞觀察具有非侵襲性，認(rèn)為可以評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞的質(zhì)量及其以后胚胎的發(fā)育潛能。

5、第1章線粒體對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟及其發(fā)育潛能的影響。 目的：線粒體數(shù)量少、功能和動(dòng)態(tài)分布的異常改變可能是體外成熟卵母細(xì)胞體外成熟率、受精率及妊娠率低的主要原因之一。這一部分研究將培養(yǎng)SD大鼠竇狀卵泡來源的卵母細(xì)胞，觀察體外成熟和卵泡大小對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響，卵母細(xì)胞線粒體的增殖、功能和動(dòng)態(tài)分布是否存在異常改變，探討卵母細(xì)胞線粒體的增殖、功能和動(dòng)態(tài)分布對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟和發(fā)育潛能的影響。 材料和方法：實(shí)驗(yàn)采用25天大小的

6、未成熟SD大鼠，收集直徑300-400μm和600-800 μm大小卵泡的卵母細(xì)胞卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合體(oocyte cumulus cellscomplex，COCs)進(jìn)行體外成熟。采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷貝數(shù)，激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體在卵母細(xì)胞中的分布，luminator檢測(cè)ATP含量，并比較體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞和各組體外成熟卵母細(xì)胞的成熟、受精和其胚胎繼續(xù)發(fā)育能力。

7、 結(jié)果：未成熟卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)和其竇狀卵泡的直徑呈顯著的線性相關(guān)(P<0.01)，R=0.68；未成熟卵母細(xì)胞的ATP含量和其竇狀卵泡的直徑也呈顯著的線性相關(guān)(P<0.05)，R=0.21。體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)(103531±25305)和從直徑600-800 μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)(85061μ37937)顯著高于從直徑300-400μm大小竇狀卵泡分離出COCs體

8、外培養(yǎng)成熟卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)(68221±22311，P<0.01)。較成熟卵母細(xì)胞，未成熟卵母細(xì)胞的的mtDNA拷貝數(shù)最少(48689±22464，P<0.01)。體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞和從直徑600-800μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細(xì)胞的受精率、卵裂率和囊胚形成率顯著高于從直徑300-400μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細(xì)胞的受精率、卵裂率和4細(xì)胞胚胎形成率(P<0.05)。體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的A

9、TP含量(1.02±0.15 pmol)和從直徑600-800μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細(xì)胞的ATP含量(0.95±0.16 pmol)顯著高于從直徑300-400μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細(xì)胞的ATP含量(0.85±0.23 pmol，P<0.05)。較成熟卵母細(xì)胞，未成熟卵母細(xì)胞的的ATP含量最少(0.62±0.14 pmol，P<0.01)。采用FCCP降低卵母細(xì)胞中ATP的含量，卵母細(xì)胞的

10、成熟率顯著降低(P<0.05)。 體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞、從直徑600-800μm大小竇狀卵泡和從直徑300-400μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)度/綠色熒光強(qiáng)度的比率分別為0.169、0.169和O.164(p>0.05)。較成熟卵母細(xì)胞，未成熟卵母細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)度/綠色熒光強(qiáng)度的比率最低(0.146，P<0.05)。較直徑300-400μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞，體內(nèi)成熟卵母

11、細(xì)胞和直徑600-800μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細(xì)胞的線粒體常分布于卵周皮質(zhì)區(qū)。 第2章體外成熟人卵母細(xì)胞中線粒體DNA和ATP含量對(duì)紡錘體PoISCOpe觀察的影響。 目的：研究將探討體外成熟人卵母細(xì)胞中mtDNA和ATP含量對(duì)紡錘體PolScope觀察的影響，紡錘體與人卵母細(xì)胞質(zhì)量的關(guān)系。 材料和方法：收集和培養(yǎng)ICSI治療周期GV期卵母細(xì)胞，采用紡錘體成像系統(tǒng)PolScope觀察紡錘體

12、，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mtDNA拷貝數(shù)，激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體在卵母細(xì)胞中的分布，luminator檢測(cè)ATP含量，比較PolScope觀察有無紡錘體的成熟卵母細(xì)胞mtDNA和ATP含量、成熟、受精和其胚胎發(fā)育能力。 結(jié)果：收集了155個(gè)ICSI治療周期GV期卵母細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后117個(gè)卵母細(xì)胞排除第一極體，成熟率為75.5﹪，其中51.3﹪(60/117)體外成熟卵在紡錘體成像系統(tǒng)PolScope下可觀察到紡錘體。在IV

13、F治療周期中，受精失敗的體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的：mtDNA拷貝數(shù)(715708±254492)顯著高于ICSI治療中GV期體外成熟的卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)(526309±209099，P<0.05)。在ICSI治療中GV期卵母細(xì)胞體外成熟中，成熟卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)和ATP含量(1.82±0.39 pmol)分別顯著高于未成熟卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)(398441±159610)和ATP含量(1.33±0.34 pmol)。

14、 可檢測(cè)到紡錘體的成熟卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)和ATP含量分別顯著高于未檢測(cè)到紡錘體的成熟卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)和ATP含量(P<0.05)?？蓹z測(cè)到紡錘體的成熟卵母細(xì)胞的正常受精率和胚胎發(fā)育能力顯著高于未檢測(cè)到紡錘體的成熟卵母細(xì)胞的正常受精率和胚胎發(fā)育能力(P<0.05)。GV期卵母細(xì)胞體外成熟后行ICSI受精，受精失敗卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)(4264044-205454)顯著低于受精后第三天低發(fā)育潛能胚胎的mtDNA拷

15、貝數(shù)(5923934-190819)和優(yōu)質(zhì)胚胎的mtDNA拷貝數(shù)(693350±180457)。 在體外培養(yǎng)液中加入FCCP后，GV期卵母細(xì)胞的體外成熟率顯著降低(P<0.001)。在FCCP處理組中，體外成熟的卵母細(xì)胞的紡錘體檢測(cè)率為23.1﹪，顯著低于無FCCP處理組體外成熟卵母細(xì)胞紡錘體的檢測(cè)率為51.3﹪(P<0.05)。此外，在FCCP處理組中，體外成熟的卵母細(xì)胞的ATP含量也顯著低于無FCCP處理組體外成熟卵母細(xì)胞的

16、ATP含量(P<0.05)。在FCCP處理組中，可檢測(cè)到紡錘體的6個(gè)成熟卵母細(xì)胞的ATP含量(1.79±0.28 pmol)明顯高于未檢測(cè)到紡錘體的20成熟卵母細(xì)胞的ATP含量(1.56±0.32 pmol)，因試驗(yàn)標(biāo)本量較小，未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.15)。而未成熟卵母細(xì)胞的ATP含量顯著低于成熟卵母細(xì)胞的ATP含量(1.00±0.36 pmol，P<0.01)。 結(jié)論： (1)盡管小竇狀卵泡的卵母細(xì)胞可體外成熟，但