羅仙子有效部位抗小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的體內(nèi)功效及對(duì)淋巴細(xì)胞的體外作用.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)嚴(yán)重危害人類的健康,免疫調(diào)控失衡在AS的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。羅仙子原名蛆,又稱五谷蟲,為我國傳統(tǒng)藥材之一,收錄于《本草綱目》蟲部第四十卷,具有清熱解毒、消滯化積及提高機(jī)體免疫力等功效。近年來,羅仙子在食品、保健品及藥品等方面的開發(fā)和利用引起社會(huì)的廣泛關(guān)注。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),羅仙子富含蛋白的提取物能夠有效改善AS小鼠動(dòng)脈血管的粥樣化病變,顯著降低動(dòng)物血清中相關(guān)炎癥因子水平;經(jīng)

2、葡聚糖凝膠色譜分離、體外抗炎活性篩選、冷凍干燥等獲得分子量在30KD以下的活性部位,其在AS小鼠體內(nèi)具有更好的抗AS功效,且發(fā)現(xiàn)其對(duì)免疫系統(tǒng)具有一定的調(diào)節(jié)作用。如前所述,免疫反應(yīng)是影響AS進(jìn)程的關(guān)鍵因素,而淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞群體,淋巴細(xì)胞及其亞群在免疫反應(yīng)中相互協(xié)作、互相制約,從而維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)?；诖?本文通過研究羅仙子有效部位在AS小鼠的體內(nèi)功效以及對(duì)淋巴細(xì)胞的體外作用,從免疫調(diào)控的角度,初步探討羅仙子有效部位抗A

3、S的作用與機(jī)制。
　　研究目的:
　　通過觀察羅仙子有效部位(Oriental Latrine Fly Larvina-Effective Fraction,OLFL-EF)抗小鼠AS的體內(nèi)功效,檢測其對(duì)動(dòng)物血脂、炎癥因子及相關(guān)免疫分子表達(dá)的影響,結(jié)合胸主動(dòng)脈及脾臟組織形態(tài)學(xué)以及淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+T細(xì)胞比例的變化情況,明確OLFL-EF在AS小鼠體內(nèi)的治療作用以及對(duì)淋巴細(xì)胞分化的影響;以脾淋巴細(xì)胞及分離的T、B細(xì)

4、胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過體外實(shí)驗(yàn)觀察OLFL-EF對(duì)上述細(xì)胞增殖、分化及分泌功能的影響,初步明確在抗AS過程中,OLFL-EF調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能的作用及機(jī)制。結(jié)合動(dòng)物整體水平、細(xì)胞水平及分子水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果,從免疫調(diào)控的角度,初步闡明OLFL-EF抗AS的作用與機(jī)制。
　　研究方法:
　　1、OLFL-EF抗小鼠AS的體內(nèi)功效
　　(1)AS小鼠模型構(gòu)建:采用高膽固醇溶液灌胃聯(lián)合LPS肌肉注射的方法建立AS小鼠模型,以灌胃方式給予

5、OLFL-EF(200mg/kg/d)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、辛伐他汀組(25mg/kg/d)和OLFL-EF組,給藥6周后,觀察治療效果。
　　(2)OLFL-EF對(duì)AS小鼠血脂的調(diào)節(jié)作用:取血清,采用膽固醇氧化酶法檢測總膽固醇(TC)水平,磷酸甘油氧化酶法測定甘油三酯(TG)水平,聚乙烯硫酸選擇性沉淀法檢測低密度脂蛋白(LDL)水平以及磷鎢酸-鎂沉淀法檢測高密度脂蛋白(HDL)水平。
　　(3)OL

6、FL-EF對(duì)AS小鼠血清中炎癥因子及相關(guān)免疫分子的影響:采用ELISA法檢測炎癥因子TNFα及IL-6水平,以及免疫分子IL-10及TGF-β1水平。
　　(4)OLFL-EF對(duì)AS小鼠胸主動(dòng)脈及脾臟組織形態(tài)學(xué)的影響:
　　①取小鼠胸主動(dòng)脈,HE染色觀察胸主動(dòng)脈的AS病理變化情況,并統(tǒng)計(jì)胸主動(dòng)脈的內(nèi)膜面積、中膜面積以及兩者的比例。
　　②取小鼠脾臟,HE染色觀察脾臟的組織形態(tài)學(xué)改變。
　?、鄄捎妹庖邿晒夥椒z測脾

7、臟中CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例。
　　2、OLFL-EF對(duì)淋巴細(xì)胞的體外作用
　　(1)OLFL-EF對(duì)脾淋巴細(xì)胞的影響:
　?、僭囵B(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞,并在不同濃度的OLFL-EF的作用下,觀察由刀豆蛋白A(ConA)及脂多糖(LPS)分別誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響,明確OLFL-EF的安全實(shí)驗(yàn)濃度。
　?、贠LFL-EF對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞的影響:設(shè)正常對(duì)照組、ConA組和ConA/OLFL-E

8、F組,采用MTT法觀察在不同時(shí)間點(diǎn)OLFL-EF對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布,并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群CD4+和CD8+T細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞比例的變化。
　?、跲LFL-EF對(duì)LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞的影響:設(shè)正常對(duì)照組、LPS組和LPS/OLFL-EF組,采用MTT法觀察在不同時(shí)間點(diǎn)OLFL-EF對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布。

9、　　(2)OLFL-EF對(duì)T細(xì)胞的影響:采用尼龍毛柱法分離T、B細(xì)胞,設(shè)正常對(duì)照組、ConA組和ConA/OLFL-EF組,采用MTT法檢測OLFL-EF在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)T細(xì)胞增殖的影響;ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中炎性因子TNFα及IL-6水平,以及免疫分子IL-10和TGF-β1水平。
　　(3)OLFL-EF對(duì)B細(xì)胞的影響:采用尼龍毛柱法分離T、B細(xì)胞,設(shè)正常對(duì)照組、LPS組和LPS/OLFL-EF組,MTT法觀察OLFL-E

10、F在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)B細(xì)胞增殖的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1、OLFL-EF抗小鼠AS的體內(nèi)功效
　　(1)AS小鼠模型建立:高膽固醇溶液灌胃聯(lián)合LPS肌肉注射的方法可成功建立AS小鼠模型,模型組小鼠的胸主動(dòng)脈出現(xiàn)典型的AS病變:內(nèi)膜增厚,內(nèi)皮細(xì)胞厚薄不均,內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落,中膜的平滑肌細(xì)胞排列紊亂,內(nèi)膜及中膜間隙明顯增大,可見泡沫細(xì)胞浸潤。胸主動(dòng)脈的內(nèi)膜面積、中膜面積顯著增大(P<0.01),兩者的比例也顯著升高(P<

11、0.01)。血清中TC、TG及LDL水平顯著升高(P<0.01),HDL水平顯著降低(P<0.01),炎癥因子TNFα及IL-6水平顯著升高(P<0.01),免疫分子IL-10及TGF-β1水平顯著降低(P<0.01)。
　　(2)OLFL-EF對(duì)AS小鼠血脂的調(diào)節(jié)作用:OLFL-EF處理6周后,血清中TC(陰性對(duì)照組vs.OLFL-EF組:6.39±0.14vs.4.53±0.05)、TG(陰性對(duì)照組vs.OLFL-EF組:3.

12、42±0.04vs.2.24±0.12)、LDL(陰性對(duì)照組vs.OLFL-EF組:3.37±0.07vs.1.91±0.08)水平顯著降低(P<0.01),HDL(陰性對(duì)照組vs.OLFL-EF組:0.83±0.15vs.1.05±0.07)水平升高(P<0.01)。
　　(3)OLFL-EF對(duì)AS小鼠血清中炎癥因子及相關(guān)免疫分子的影響:OLFL-EF處理6周后,血清中炎癥因子TNFα(陰性對(duì)照組vs.OLFL-EF組:1.74

13、±0.03vs.1.24±0.14)及IL-6(陰性對(duì)照組vs.OLFL-EF組:74.36±0.53vs.41.62±0.03)的水平顯著降低(P<0.01),免疫分子IL-10(陰性對(duì)照組vs.OLFL-EF組:25.23±0.31vs.59.89±0.21)和TGF-β1(陰性對(duì)照組vs.OLFL-EF組:82.27±0.11vs.187.14±0.18)的水平顯著升高(P<0.01)。
　　(4)OLFL-EF對(duì)AS小鼠胸

14、主動(dòng)脈及脾臟的組織形態(tài)學(xué)的影響:
　　①小鼠胸主動(dòng)脈病理變化:OLFL-EF處理小鼠6周后,小鼠胸主動(dòng)脈血管厚度明顯變薄,中膜與內(nèi)膜輪廓邊緣清晰可見,泡沫細(xì)胞堆積減少,AS病變得到明顯改善。胸主動(dòng)脈的內(nèi)膜面積(陰性對(duì)照組vs.OLFL-EF組:8551.9±188.45vs.1874.2±132.32)、中膜面積(陰性對(duì)照組vs.OLFL-EF組:17215±243.52vs.14385±241.19)顯著增大(P<0.01),兩

15、者的比例(陰性對(duì)照組vs.OLFL-EF組:0.497±0.134vs.0.130±0.027)也顯著升高(P<0.01)。
　?、谄⑴K組織形態(tài)學(xué)變化:OLFL-EF處理小鼠后,小鼠的脾小體邊緣較清晰,可見生發(fā)中心有B細(xì)胞產(chǎn)生,動(dòng)脈周圍淋巴鞘邊緣較小,T細(xì)胞數(shù)量減少。
　?、燮⑴K中CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例變化:OLFL-EF處理小鼠后,T細(xì)胞的聚集減少,CD4+和CD8+T細(xì)胞比例降低。
　　2、OLFL-EF在

16、體外對(duì)淋巴細(xì)胞增殖、分化及分泌功能的影響
　　(1)OLFL-EF對(duì)脾淋巴細(xì)胞的影響
　　①原代培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞的結(jié)果:小鼠脾淋巴細(xì)胞為懸浮生長,圓形,折光度好,均勻分散于培養(yǎng)介質(zhì)中。
　　②確定安全有效實(shí)驗(yàn)濃度:不同濃度的OLFL-EF作用于ConA及LPS分別誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,OLFL-EF在濃度為5-100μg/mL的范圍內(nèi),均能顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖(P<0.01),在濃度范圍5-40μg/

17、mL呈一定劑量的依賴性,在濃度為40μg/mL時(shí),其促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用最為明顯,高于40μg/mL時(shí),促增殖作用下降(可能是細(xì)胞毒性),故本實(shí)驗(yàn)選取40μg/mL為最佳安全有效實(shí)驗(yàn)濃度。
　　③OLFL-EF對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的作用:
　　OLFL-EF在12h-72h的時(shí)間范圍內(nèi),均能顯著促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖(P<0.01),且在12h-48h的范圍內(nèi),呈一定的時(shí)間依賴性。在培養(yǎng)48h(ConA

18、組vs.ConA/OLFL-EF組:0.407±0.003vs.0.698±0.004)后,其增殖促進(jìn)率(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:91.67±0.29vs.180.11±0.47)升高最為顯著。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布的結(jié)果顯示:OLFL-EF能顯著降低ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞的百分比(P<0.01),升高S期和G2/M期細(xì)胞的百分比(P<0.01),在OLFL-EF處理48h后,

19、其S期分?jǐn)?shù)(S-Phase fraction,SPF)(12.23±0.2％)及增殖指數(shù)(Proliferation index,PI)(21.50±0.96%)最大,表明在48h時(shí),OLFL-EF促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期和G2/M期的作用最明顯。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群CD4+和CD8+T細(xì)胞比例的結(jié)果顯示:OLFL-EF處理細(xì)胞24h、48h和72h后,CD4+T細(xì)胞比例顯著降低(P<0.0

20、1),CD4+/CD8+比值在24h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:1.60±0.35vs.1.34±0.89)、48h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:1.64±0.21VS1.26±0.28)、72h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:1.63±0.43vs.1.24±0.31)均顯著降低(P<0.01),分別下降了0.26、0.38和0.39。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg細(xì)胞比例的結(jié)果顯示

21、:OLFL-EF處理細(xì)胞24h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:6.21±0.13vs.7.49±0.22)、48h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:6.96±0.32vs.10.22±0.78)后,Treg細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01)。
　　④OLFL-EF對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的作用:
　　OLFL-EF在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的作用結(jié)果顯示:OLFL-EF在12h-72

22、h的范圍內(nèi),均能顯著促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖(P<0.01),在12h-48h的范圍內(nèi),呈一定的時(shí)間依賴性。培養(yǎng)48h(LPS組vs.LPS/OLFL-EF組:0.356±0.003vs.0.565±0.002)后,其增殖促進(jìn)率(LPS組vs.LPS/OLFL-EF組:71.37±0.93vs.102.15±0.32)最大,OLFL-EF促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖效果最明顯。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布的結(jié)果

23、顯示:OLFL-EF能顯著降低LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞的百分比(P<0.01),升高S期和G2/M期細(xì)胞的百分比(P<0.01),在OLFL-EF處理72h后,其SPF值(6.03±0.59%)及PI值(13.24±0.45%)最大,表明在72h時(shí),OLFL-EF促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期和G2/M期的作用最明顯。
　　(2)OLFL-EF對(duì)T細(xì)胞的影響
　　尼龍毛柱法將T、B細(xì)胞分離后,T細(xì)胞經(jīng)OL

24、FL-EF處理24h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:0.305±0.003vs.0.265±0.015)和48h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:0.315±0.032vs.0.242±0.008)后,能顯著抑制T細(xì)胞增殖(P<0.01),其增殖率在48h(ConA組vs.ConA/OLFL-EF組:5.15±0.13vs.-7.41±0.06)時(shí)最小,表明在48h時(shí),OLFL-EF能顯著抑制T細(xì)胞增殖(P<0

25、.01)。
　　培養(yǎng)液上清中炎癥因子TNFα(正常對(duì)照組vs.OLFL-EF組:1.22±0.13vs.1.14±0.145)及IL-6(正常對(duì)照組vs.OLFL-EF組:40.58±0.26vs.33.42±0.13)水平顯著降低(P<0.01),免疫分子IL-10(正常對(duì)照組vs.OLFL-EF組:63.17±0.45vs.72.47±0.18)和TGF-β1(正常對(duì)照組vs.OLFL-EF組:190.31±0.23vs.19

26、9.14±0.48)水平顯著升高(P<0.01)。
　　(3)OLFL-EF對(duì)B細(xì)胞的影響
　　OLFL-EF處理B細(xì)胞24h(LPS組vs.LPS/OLFL-EF組:0.323±0.004vs.0.345±0.021)和48h(LPS組vs.LPS/OLFL-EF組:0.346±0.017vs.363±0.013)后,能顯著促進(jìn)B細(xì)胞增殖(P<0.01),其增殖率在48h(LPS組vs.LPS/OLFL-EF組:27.48