Genistein藥物后適應對大鼠缺血-再灌注心肌的保護作用及其機制研究.pdf

1、盡管在冠狀動脈阻塞后及早恢復缺血心肌的血液灌注對挽救心肌死亡是至關重要的，但大量臨床和實驗研究發(fā)現，在一定條件下，當組織、器官重新獲得血液供應時，不但未使組織細胞原有的缺血性損害減輕或恢復，反而進一步產生了新的有害損傷，這種損傷被稱為缺血再灌注損傷。 Genistein(GST)是1931年第一個從大豆中分離出的異黃酮類物質，它可以通過多種機制作用于靶組織，發(fā)揮多種生物學效應。它通過抗氧化和清除活性氧、抑制心肌鈣超載、降血脂、影

2、響血管反應性、抑制平滑肌細胞增殖、抑制心肌細胞凋亡、抗血栓形成等機制，對心血管疾病的預防和治療產生積極的作用。心肌再灌注后迅速生成的活性氧類物質和細胞內Ca<'2+>超載是啟動心肌缺血再灌注損傷病理過程的兩個最重要的觸發(fā)因素。Genistein具有抗氧化、清除活性氧和抑制心肌鈣超載的作用，因此將其確定為減輕心肌缺血再灌注損傷的候選藥物。利用在體、離體大鼠心肌缺血再灌注模型檢驗Genistein可能具有的藥物后適應心肌保護作用及其機制。

3、 研究目的： 1、利用在體大鼠心臟局部缺血再灌注模型，通過測量大鼠心肌梗塞面積、心肌酶和心功能指標的變化，以及觀測心肌組織病理形態(tài)學和超微結構的變化，明確Genistein對缺血再灌注損傷后的大鼠心肌是否存在藥物后適應的保護效應。 2、通過觀察Genistein對缺血再灌注損傷后的大鼠心肌組織、血清中NOS活力和NO含量變化的影響，以及對缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡的影響，結合在離體心臟局部缺血再灌注下，觀測雌激素

4、受體拮抗劑ICI 182780和酪氨酸磷酸酶抑制劑正釩酸鈉對Genistein心肌保護效應的干預效果，分析Genistein產生藥物后適應心肌保護效應的可能機制。 研究方法： 1、在體大鼠心臟局部缺血再灌注模型和Genistein藥物后適應給藥方式的建立 實驗采用240～260 g健康Wistar大鼠，按照丁延風等報道的方法建立在體大鼠心臟局部缺血再灌注模型。可逆性結扎左冠狀動脈前降支，阻斷左冠狀動脈前降支血流，

5、造成心肌缺血，心電圖顯示ST段抬高≥0.15 mV時為模型缺血成功，缺血30分鐘。松開結扎線實現再灌注，再灌注3小時。實驗分為假手術組、缺血再灌注組、Genistein 0.1 mg/kg組、Genistein 0.3 mg/kg組、Genistein 1.0 mg/kg組、Genistein 2.0 mg/kg組和Genistein 5.0mg/kg組等七組。各不同劑量Genistein組，從再灌注開始前20秒至再灌注第1分鐘結束，經

6、股靜脈微量推注方式給藥。 2、心臟梗死面積的測定 實驗結束時，從測壓管側孔，經頸動脈迅速注入2％Even’s blue 2ml，待大鼠口唇及足部藍染后快速取出心臟，剔除左心室以外部分，將左心室垂直于心臟縱軸方向自心底向心尖平均切成六片環(huán)形的薄片，在37℃于1％TTC中避光孵育15 min后，用10％甲醛溶液固定24～48 h。用掃描儀對心臟切面進行掃描，利用image-pro plus圖像分析軟件測定心肌危險區(qū)與梗塞區(qū)面

7、積，對數據進行多組間單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計分析。 3、心肌組織病理形態(tài)學和超微結構變化的觀察 各組實驗完成后，迅速取出心臟置于0℃生理鹽水中，洗凈心腔內殘血，剪取冠狀動脈前降支結扎線下約2 mm處左室前壁組織(約0.2×0.2 cm<'2>大小)，經10％甲醛溶液固定后24～48 h，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，常規(guī)HE染色，光鏡(400×)下觀察心肌組織病理形態(tài)學改變。留取的心肌左室前壁組織浸于2.5％戊二醛中

8、，固定2～4小時，再用四氧鋨酸固定2小時，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片，鈾-鉛雙重染色，透射電鏡(6000～20000×)下觀察心肌組織超微結構改變。 4、血清、心肌組織中酶學指標的測定 實驗結束時，經頸動脈測壓管的側孔，取動脈血1.5 ml，2000 r/min離心10 min，取上清，進行血清酶學指標測定;實驗結束后，快速取出心臟，置于0℃生理鹽水中，洗凈心腔內殘血，剪取冠狀動脈前降支結扎線下約2 mln處

9、左室前壁組織(約0.2 × 0.2cm<'2>大小)，制備10％的大鼠心肌組織勻漿，取心肌組織勻漿，10000 r/min離心10 min，取上清，進行心肌酶學指標測定。 采用Bionewtrans Pharmaciutical Biotechnology Co.，Ltd.的goat anti-rat cardiac TroponinⅠ試劑盒，用夾心酶聯免疫吸附測試法(定量)檢測血清中心肌肌鈣蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)含量：采用南京建成

10、生物工程研究所的丙二醛(MDA)試劑盒，用TAB法測定心肌組織中的MDA含量；采用南京建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，用黃嘌呤氧化酶法測定心肌組織中的總超氧化物歧化酶(T-SOD)，對數據進行多組間單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計分析。 5、心功能指標的監(jiān)測 在實驗過程中用RM6240B生物信號采集處理系統(tǒng)2.0e全程記錄從缺血前到再灌注3小時結束后的心電圖和左心室內壓力波形。在缺血后30 min、再

11、灌注10 min、再灌注30 min、再灌注60 min、再灌注120 min和再灌注180 min等時間點，測定HR、LVSP、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax等心功能指標與缺血前相比，計算得到HR、LVSP-LVDP、+dp/&max和-dp/dtmax的回復率數據，應用重復測量的方差分析模型進行對比分析。 6、血清NO含量和心肌組織NOS活力(分型)的測定 血清和心肌組織勻漿檢測標本的制備同方法4。

12、采用南京建成生物工程研究所的一氧化氮(NO)測定試劑盒，用化學法測定血清中NO含量；采用南京建成生物工程研究所的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)測定試劑盒(分型)，測定心肌組織中的總NOS活力和iNOS活力，計算eNOS活力，對數據進行多組間單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計分析。 7、心肌細胞凋亡的觀測 采用德國Roche Diagnostics GmbH Mannheim公司的TUNE

13、L凋亡檢測試劑盒測定各實驗組心肌組織中的凋亡細胞。留取的心肌左室前壁組織，經10％甲醛溶液固定后24～48 h，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，用經多聚賴氨酸包被的玻片制作石蠟切片，嚴格按試劑盒說明書操作，制作TUNEL法凋亡檢測石蠟切片，用熒光顯微鏡對切片上的凋亡細胞進行計數，計算凋亡指數，對數據進行多組間單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計分析。 心肌組織勻漿檢測標本的制備同方法4，利用美國Biological公司的Caspase.3

14、凋亡檢測試劑盒測定各實驗組心肌組織中的Caspase-3活性，計算各組Caspase-3的比活性，對數據進行多組間單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計分析。 8、離體大鼠心臟局部缺血再灌注模型和藥物干預方式的建立 實驗采用240～260 g健康Wistar大鼠，利用Langendorff離體心臟灌流技術，按照Hausenloy等報道的方法建立離體大鼠心臟局部缺血再灌注模型。離體心臟從主動脈插管，懸掛于Langendorff裝

15、置上，行主動脈逆行灌注，恒定流速9 ml/min?？赡嫘越Y扎左冠狀動脈前降支，阻斷左冠狀動脈前降支灌流，造成心肌缺血，心電圖顯示ST段抬高≥0.15 mV時為模型缺血成功，缺血30分鐘。松開結扎線實現再灌注，再灌注3小時。應用工具藥物雌激素受體拮抗劑ICI 182780和酪氨酸磷酸酶抑制劑正釩酸鈉，觀測離體大鼠心肌梗塞面積、心肌酶和心功能等指標變化。實驗分為假結扎組、缺血再灌注組、Genistein組、ICI182780組、正釩酸鈉組、

16、Genistein+ICI 182780組和Genistein+正釩酸鈉組等七組。在再灌注前1 min，分別用含有藥物的灌注液給予干預，直到再灌注后9 min，共干預10 min，建立不同藥物干預組。 研究結論： 1、利用在體大鼠心臟局部缺血再灌注模型證實，在再灌注早期靜脈給予Genistein能有效減輕心肌缺血再灌注損傷。表現為心肌梗死面積減小，心肌肌鈣蛋白Ⅰ和MDA含量下降，SOD活力升高，心功能指標回復率提高，心肌

17、超微結構的破壞明顯減輕，多方面地顯示了Genistein藥物后適應的心肌保護作用。 2、在0.1～5.0 mg/kg劑量范圍內，Genistein都具有明顯的心肌保護作用，但表現出雙向的劑量依賴性。在0.1～1.0 mg/kg劑量范圍內其保護效應呈劑量依賴性增強，而在1.0～5.0mg/kg劑量范圍內呈劑量依賴性減弱。 3、通過心肌NOS活性與血清NO含量的測定，凋亡指數和Caspase-3比活性的測定，結合對雌激素受體