Genistein藥物后適應(yīng)對(duì)大鼠缺血-再灌注心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、盡管在冠狀動(dòng)脈阻塞后及早恢復(fù)缺血心肌的血液灌注對(duì)挽救心肌死亡是至關(guān)重要的，但大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，當(dāng)組織、器官重新獲得血液供應(yīng)時(shí)，不但未使組織細(xì)胞原有的缺血性損害減輕或恢復(fù)，反而進(jìn)一步產(chǎn)生了新的有害損傷，這種損傷被稱為缺血再灌注損傷。 Genistein(GST)是1931年第一個(gè)從大豆中分離出的異黃酮類物質(zhì)，它可以通過多種機(jī)制作用于靶組織，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。它通過抗氧化和清除活性氧、抑制心肌鈣超載、降血脂、影

2、響血管反應(yīng)性、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抑制心肌細(xì)胞凋亡、抗血栓形成等機(jī)制，對(duì)心血管疾病的預(yù)防和治療產(chǎn)生積極的作用。心肌再灌注后迅速生成的活性氧類物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>超載是啟動(dòng)心肌缺血再灌注損傷病理過程的兩個(gè)最重要的觸發(fā)因素。Genistein具有抗氧化、清除活性氧和抑制心肌鈣超載的作用，因此將其確定為減輕心肌缺血再灌注損傷的候選藥物。利用在體、離體大鼠心肌缺血再灌注模型檢驗(yàn)Genistein可能具有的藥物后適應(yīng)心肌保護(hù)作用及其機(jī)制。

3、 研究目的： 1、利用在體大鼠心臟局部缺血再灌注模型，通過測量大鼠心肌梗塞面積、心肌酶和心功能指標(biāo)的變化，以及觀測心肌組織病理形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化，明確Genistein對(duì)缺血再灌注損傷后的大鼠心肌是否存在藥物后適應(yīng)的保護(hù)效應(yīng)。 2、通過觀察Genistein對(duì)缺血再灌注損傷后的大鼠心肌組織、血清中NOS活力和NO含量變化的影響，以及對(duì)缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)合在離體心臟局部缺血再灌注下，觀測雌激素

4、受體拮抗劑ICI 182780和酪氨酸磷酸酶抑制劑正釩酸鈉對(duì)Genistein心肌保護(hù)效應(yīng)的干預(yù)效果，分析Genistein產(chǎn)生藥物后適應(yīng)心肌保護(hù)效應(yīng)的可能機(jī)制。 研究方法： 1、在體大鼠心臟局部缺血再灌注模型和Genistein藥物后適應(yīng)給藥方式的建立 實(shí)驗(yàn)采用240～260 g健康Wistar大鼠，按照丁延風(fēng)等報(bào)道的方法建立在體大鼠心臟局部缺血再灌注模型?？赡嫘越Y(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支血流，

5、造成心肌缺血，心電圖顯示ST段抬高≥0.15 mV時(shí)為模型缺血成功，缺血30分鐘。松開結(jié)扎線實(shí)現(xiàn)再灌注，再灌注3小時(shí)。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、Genistein 0.1 mg/kg組、Genistein 0.3 mg/kg組、Genistein 1.0 mg/kg組、Genistein 2.0 mg/kg組和Genistein 5.0mg/kg組等七組。各不同劑量Genistein組，從再灌注開始前20秒至再灌注第1分鐘結(jié)束，經(jīng)

6、股靜脈微量推注方式給藥。 2、心臟梗死面積的測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從測壓管側(cè)孔，經(jīng)頸動(dòng)脈迅速注入2％Even’s blue 2ml，待大鼠口唇及足部藍(lán)染后快速取出心臟，剔除左心室以外部分，將左心室垂直于心臟縱軸方向自心底向心尖平均切成六片環(huán)形的薄片，在37℃于1％TTC中避光孵育15 min后，用10％甲醛溶液固定24～48 h。用掃描儀對(duì)心臟切面進(jìn)行掃描，利用image-pro plus圖像分析軟件測定心肌危險(xiǎn)區(qū)與梗塞區(qū)面

7、積，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析。 3、心肌組織病理形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化的觀察 各組實(shí)驗(yàn)完成后，迅速取出心臟置于0℃生理鹽水中，洗凈心腔內(nèi)殘血，剪取冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎線下約2 mm處左室前壁組織(約0.2×0.2 cm<'2>大小)，經(jīng)10％甲醛溶液固定后24～48 h，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，常規(guī)HE染色，光鏡(400×)下觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變。留取的心肌左室前壁組織浸于2.5％戊二醛中

8、，固定2～4小時(shí)，再用四氧鋨酸固定2小時(shí)，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片，鈾-鉛雙重染色，透射電鏡(6000～20000×)下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變。 4、血清、心肌組織中酶學(xué)指標(biāo)的測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，經(jīng)頸動(dòng)脈測壓管的側(cè)孔，取動(dòng)脈血1.5 ml，2000 r/min離心10 min，取上清，進(jìn)行血清酶學(xué)指標(biāo)測定;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，快速取出心臟，置于0℃生理鹽水中，洗凈心腔內(nèi)殘血，剪取冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎線下約2 mln處

9、左室前壁組織(約0.2 × 0.2cm<'2>大小)，制備10％的大鼠心肌組織勻漿，取心肌組織勻漿，10000 r/min離心10 min，取上清，進(jìn)行心肌酶學(xué)指標(biāo)測定。 采用Bionewtrans Pharmaciutical Biotechnology Co.，Ltd.的goat anti-rat cardiac TroponinⅠ試劑盒，用夾心酶聯(lián)免疫吸附測試法(定量)檢測血清中心肌肌鈣蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)含量：采用南京建成

10、生物工程研究所的丙二醛(MDA)試劑盒，用TAB法測定心肌組織中的MDA含量；采用南京建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，用黃嘌呤氧化酶法測定心肌組織中的總超氧化物歧化酶(T-SOD)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析。 5、心功能指標(biāo)的監(jiān)測 在實(shí)驗(yàn)過程中用RM6240B生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)2.0e全程記錄從缺血前到再灌注3小時(shí)結(jié)束后的心電圖和左心室內(nèi)壓力波形。在缺血后30 min、再

11、灌注10 min、再灌注30 min、再灌注60 min、再灌注120 min和再灌注180 min等時(shí)間點(diǎn)，測定HR、LVSP、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax等心功能指標(biāo)與缺血前相比，計(jì)算得到HR、LVSP-LVDP、+dp/&max和-dp/dtmax的回復(fù)率數(shù)據(jù)，應(yīng)用重復(fù)測量的方差分析模型進(jìn)行對(duì)比分析。 6、血清NO含量和心肌組織NOS活力(分型)的測定 血清和心肌組織勻漿檢測標(biāo)本的制備同方法4。

12、采用南京建成生物工程研究所的一氧化氮(NO)測定試劑盒，用化學(xué)法測定血清中NO含量；采用南京建成生物工程研究所的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)測定試劑盒(分型)，測定心肌組織中的總NOS活力和iNOS活力，計(jì)算eNOS活力，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析。 7、心肌細(xì)胞凋亡的觀測 采用德國Roche Diagnostics GmbH Mannheim公司的TUNE

13、L凋亡檢測試劑盒測定各實(shí)驗(yàn)組心肌組織中的凋亡細(xì)胞。留取的心肌左室前壁組織，經(jīng)10％甲醛溶液固定后24～48 h，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，用經(jīng)多聚賴氨酸包被的玻片制作石蠟切片，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，制作TUNEL法凋亡檢測石蠟切片，用熒光顯微鏡對(duì)切片上的凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析。 心肌組織勻漿檢測標(biāo)本的制備同方法4，利用美國Biological公司的Caspase.3

14、凋亡檢測試劑盒測定各實(shí)驗(yàn)組心肌組織中的Caspase-3活性，計(jì)算各組Caspase-3的比活性，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析。 8、離體大鼠心臟局部缺血再灌注模型和藥物干預(yù)方式的建立 實(shí)驗(yàn)采用240～260 g健康Wistar大鼠，利用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，按照Hausenloy等報(bào)道的方法建立離體大鼠心臟局部缺血再灌注模型。離體心臟從主動(dòng)脈插管，懸掛于Langendorff裝

15、置上，行主動(dòng)脈逆行灌注，恒定流速9 ml/min?？赡嫘越Y(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支灌流，造成心肌缺血，心電圖顯示ST段抬高≥0.15 mV時(shí)為模型缺血成功，缺血30分鐘。松開結(jié)扎線實(shí)現(xiàn)再灌注，再灌注3小時(shí)。應(yīng)用工具藥物雌激素受體拮抗劑ICI 182780和酪氨酸磷酸酶抑制劑正釩酸鈉，觀測離體大鼠心肌梗塞面積、心肌酶和心功能等指標(biāo)變化。實(shí)驗(yàn)分為假結(jié)扎組、缺血再灌注組、Genistein組、ICI182780組、正釩酸鈉組、

16、Genistein+ICI 182780組和Genistein+正釩酸鈉組等七組。在再灌注前1 min，分別用含有藥物的灌注液給予干預(yù)，直到再灌注后9 min，共干預(yù)10 min，建立不同藥物干預(yù)組。 研究結(jié)論： 1、利用在體大鼠心臟局部缺血再灌注模型證實(shí)，在再灌注早期靜脈給予Genistein能有效減輕心肌缺血再灌注損傷。表現(xiàn)為心肌梗死面積減小，心肌肌鈣蛋白Ⅰ和MDA含量下降，SOD活力升高，心功能指標(biāo)回復(fù)率提高，心肌

17、超微結(jié)構(gòu)的破壞明顯減輕，多方面地顯示了Genistein藥物后適應(yīng)的心肌保護(hù)作用。 2、在0.1～5.0 mg/kg劑量范圍內(nèi)，Genistein都具有明顯的心肌保護(hù)作用，但表現(xiàn)出雙向的劑量依賴性。在0.1～1.0 mg/kg劑量范圍內(nèi)其保護(hù)效應(yīng)呈劑量依賴性增強(qiáng)，而在1.0～5.0mg/kg劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴性減弱。 3、通過心肌NOS活性與血清NO含量的測定，凋亡指數(shù)和Caspase-3比活性的測定，結(jié)合對(duì)雌激素受體