人核心蛋白聚糖真核載體構(gòu)建及其體內(nèi)外抑瘤作用研究.pdf

1、核心蛋白聚糖(decorin，DCN)為蛋白聚糖(proteoglycan，PG)的一種，是一種多效性分子。在調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、遷徙、增殖、膠原纖維形成及調(diào)節(jié)TGF-β活性中起重要作用，因而可抗組織纖維化及抑制腫瘤生長(zhǎng)。人DCN(human decorin，hDCN)基因外顯子序列長(zhǎng)1080bp，編碼395個(gè)氨基酸。 目的:建立hDCN的pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)

2、胞的凋亡指數(shù)，同時(shí)在小鼠體內(nèi)進(jìn)行DCN抑瘤實(shí)驗(yàn)的初步研究。 方法: 1.用PCR法擴(kuò)增出hDCN分子編碼序列的cDNA全長(zhǎng)，與pcDNA3.1(+)載體連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-DCN，并轉(zhuǎn)入DH5α進(jìn)行測(cè)序鑒定；2.將序列正確的pcDNA3.1(+)-DCN大量純化擴(kuò)增后，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入小鼠腫瘤細(xì)胞S180中，然后用不同濃度的G418篩選陽性克隆細(xì)胞，提取陽性克隆細(xì)胞的RNA，并進(jìn)行RT-PCR鑒定；

3、3.用流式細(xì)胞儀對(duì)轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-DCN、空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的S180細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的S180細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)和細(xì)胞周期分析；4.分別注射等量的pcDNA3.1(+)-DCN/S180、pcDNA3.1(+)/S180和S180細(xì)胞到隨機(jī)分組的小鼠腋部皮下，觀察三組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況；5.處死三組小鼠后，分別剝離腫瘤組織做病理切片鑒定。 結(jié)果: 1.擴(kuò)增出的hDCN片段測(cè)序的結(jié)果，與GenBan

4、k中的DCN基因序列相比，序列完全一致，無突變；2.構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-DCN，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)入S180細(xì)胞后，篩選出抗高濃度(900μg/ml)G418的陽性克隆，并用RT-PCR法進(jìn)行鑒定；3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-DCN的S180細(xì)胞凋亡率明顯高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的S180細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的S180細(xì)胞，且其G<,0>/G<,1>期細(xì)胞百分率明顯高于后兩組，G<,2>/M期和S期

5、細(xì)胞百分率明顯低于后兩組，三組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4.大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)染陽性克隆細(xì)胞，將其注入小鼠體內(nèi)，同時(shí)選擇未轉(zhuǎn)染的S180細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的S180細(xì)胞注入小鼠作為對(duì)照組，結(jié)果顯示注射pcDNA3.1(+)-DCN/S180的小鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯慢于注射S180和pcDNA3.1(+)/S180的小鼠，三組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P·<0.05)；5.三組病理切片均可見腫瘤細(xì)胞增殖，且pcDNA3.1(+)-