pprl基因轉染治療小鼠輻射損傷的病理學及pprl蛋白純化方法的研究.pdf

1、目的:PprI基因是一個放射性損傷修復的關鍵基因,其產物PprI蛋白是耐輻射球菌所專有的,能夠促使RecA、PprA等DNA重組修復有關因子的顯著表達。本課題組利用活體基因電轉染技術,將我科室自行構建的PprI基因真核表達質粒pEGFP-c1-pprI及空載體質粒pEGFP-c1轉入小鼠體內,從組織器官病理學的角度探討PprI基因表達對γ射線急性照射動物的抗輻射作用及其機理。同時本課題組在本實驗室的研究基礎上對自行構建的含有PprI基因

2、的pHBM-6×His-PprI的畢赤酵母GS115菌株轉化子誘導高效表達PprI蛋白,通過進一步研究PprI蛋白的純化方法,得到高純度的PprI蛋白,為闡明其發(fā)揮生物效應的機制供應更多的實驗材料。
　　材料與方法:采用BABL/c雄性小鼠,隨機分為對照組、單純照射組、空載體組和轉染組。用質粒抽提試劑盒提取大腸桿菌重組質粒pEGFP-c1-pprI及空載體質粒pEGFP-c1,應用活體基因電轉導技術,將PprI重組質粒及空載體質粒

3、分別轉入小鼠腿部肌纖維細胞,死亡率觀察組用60Coγ射線進行全身照射,吸收劑量總計6 Gy,劑量率為2 Gy/min,病理實驗組吸收劑量總計4 Gy,劑量率為2 Gy/min。觀察γ射線輻射損傷對小鼠的死亡率;取小鼠心臟、肺臟、腎臟和睪丸,固定做石蠟切片,HE染色,觀測γ射線輻射損傷引起小鼠在不同時間點各組織器官的病理學改變。將本實驗自行構建的pHBM-6×His-PprI畢赤酵母工程菌擴大培養(yǎng),添加純甲醇至最后濃度為1％誘導蛋白表達,

4、利用SDS-PAGE電泳,Western blot檢測最終蛋白產物。通過過濾、PBS透析、金屬鎳螯合親和層析等步驟純化蛋白,SDS-PAGE電泳,Western blot再次檢測最終純化后的蛋白。
　　結果:6 Gy的γ射線可引起小鼠急性致死性放射損傷,轉染組小鼠的死亡率為30％,與單純照射組小鼠70％的死亡率和空載體組小鼠60％的死亡率相比顯著降低。肺臟病理觀測結果顯示,轉染組的小鼠在照后初期肺泡毛細血管的充血、水腫、炎性滲出以

5、及照射后期肺氣腫的形成、肺泡隔纖維增厚等輻射損傷表現(xiàn)均顯著輕于其他組;腎組織病理結果顯示,轉染組腎毛細血管擴張充血、腎小球腫大及腎小管上皮細胞萎縮壞死程度稍輕于其他組;睪丸病理結果顯示,初期各組都出現(xiàn)嚴重的輻射損傷,各級精原細胞大量變性壞死,轉染組程度稍輕,在照射28天后,轉染組的部分生精小管出現(xiàn)了新生的精原細胞,而其他組未有此改變,PprI基因可提前睪丸組織的損傷修復;心肌細胞相對射線敏感度較低未見明顯損傷。通過對含PprI基因的畢赤

6、酵母工程菌上清液的SDS-PAGE電泳、Western blot測定,表明PprI蛋白成功表達,相對分子質量約為43 kDa。上清液過濾、透析、金屬鎳鰲合親和層析后蛋白成功純化,獲得較多高純度PprI蛋白,再次采用SDS-PAGE電泳、Western blot檢測證實為PprI蛋白。
　　結論:
　　1. PprI基因活體電轉染在哺乳動物體內的表達可明顯降低γ射線照射小鼠的死亡率。
　　2. PprI基因活體電轉染對γ