pprl基因轉(zhuǎn)染治療小鼠輻射損傷的病理學(xué)及pprl蛋白純化方法的研究.pdf

1、目的:PprI基因是一個(gè)放射性損傷修復(fù)的關(guān)鍵基因,其產(chǎn)物PprI蛋白是耐輻射球菌所專有的,能夠促使RecA、PprA等DNA重組修復(fù)有關(guān)因子的顯著表達(dá)。本課題組利用活體基因電轉(zhuǎn)染技術(shù),將我科室自行構(gòu)建的PprI基因真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-c1-pprI及空載體質(zhì)粒pEGFP-c1轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi),從組織器官病理學(xué)的角度探討PprI基因表達(dá)對(duì)γ射線急性照射動(dòng)物的抗輻射作用及其機(jī)理。同時(shí)本課題組在本實(shí)驗(yàn)室的研究基礎(chǔ)上對(duì)自行構(gòu)建的含有PprI基因

2、的pHBM-6×His-PprI的畢赤酵母GS115菌株轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)高效表達(dá)PprI蛋白,通過(guò)進(jìn)一步研究PprI蛋白的純化方法,得到高純度的PprI蛋白,為闡明其發(fā)揮生物效應(yīng)的機(jī)制供應(yīng)更多的實(shí)驗(yàn)材料。
　　材料與方法:采用BABL/c雄性小鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組、單純照射組、空載體組和轉(zhuǎn)染組。用質(zhì)粒抽提試劑盒提取大腸桿菌重組質(zhì)粒pEGFP-c1-pprI及空載體質(zhì)粒pEGFP-c1,應(yīng)用活體基因電轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù),將PprI重組質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒

3、分別轉(zhuǎn)入小鼠腿部肌纖維細(xì)胞,死亡率觀察組用60Coγ射線進(jìn)行全身照射,吸收劑量總計(jì)6 Gy,劑量率為2 Gy/min,病理實(shí)驗(yàn)組吸收劑量總計(jì)4 Gy,劑量率為2 Gy/min。觀察γ射線輻射損傷對(duì)小鼠的死亡率;取小鼠心臟、肺臟、腎臟和睪丸,固定做石蠟切片,HE染色,觀測(cè)γ射線輻射損傷引起小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)各組織器官的病理學(xué)改變。將本實(shí)驗(yàn)自行構(gòu)建的pHBM-6×His-PprI畢赤酵母工程菌擴(kuò)大培養(yǎng),添加純甲醇至最后濃度為1％誘導(dǎo)蛋白表達(dá),

4、利用SDS-PAGE電泳,Western blot檢測(cè)最終蛋白產(chǎn)物。通過(guò)過(guò)濾、PBS透析、金屬鎳螯合親和層析等步驟純化蛋白,SDS-PAGE電泳,Western blot再次檢測(cè)最終純化后的蛋白。
　　結(jié)果:6 Gy的γ射線可引起小鼠急性致死性放射損傷,轉(zhuǎn)染組小鼠的死亡率為30％,與單純照射組小鼠70％的死亡率和空載體組小鼠60％的死亡率相比顯著降低。肺臟病理觀測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組的小鼠在照后初期肺泡毛細(xì)血管的充血、水腫、炎性滲出以

5、及照射后期肺氣腫的形成、肺泡隔纖維增厚等輻射損傷表現(xiàn)均顯著輕于其他組;腎組織病理結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組腎毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、腎小球腫大及腎小管上皮細(xì)胞萎縮壞死程度稍輕于其他組;睪丸病理結(jié)果顯示,初期各組都出現(xiàn)嚴(yán)重的輻射損傷,各級(jí)精原細(xì)胞大量變性壞死,轉(zhuǎn)染組程度稍輕,在照射28天后,轉(zhuǎn)染組的部分生精小管出現(xiàn)了新生的精原細(xì)胞,而其他組未有此改變,PprI基因可提前睪丸組織的損傷修復(fù);心肌細(xì)胞相對(duì)射線敏感度較低未見(jiàn)明顯損傷。通過(guò)對(duì)含PprI基因的畢赤

6、酵母工程菌上清液的SDS-PAGE電泳、Western blot測(cè)定,表明PprI蛋白成功表達(dá),相對(duì)分子質(zhì)量約為43 kDa。上清液過(guò)濾、透析、金屬鎳鰲合親和層析后蛋白成功純化,獲得較多高純度PprI蛋白,再次采用SDS-PAGE電泳、Western blot檢測(cè)證實(shí)為PprI蛋白。
　　結(jié)論:
　　1. PprI基因活體電轉(zhuǎn)染在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)可明顯降低γ射線照射小鼠的死亡率。
　　2. PprI基因活體電轉(zhuǎn)染對(duì)γ