實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠模型及miR-23a慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠成骨細(xì)胞的建立.pdf

1、在各種頜骨、牙周、根尖周慢性炎癥中,病灶區(qū)都會(huì)形成病理性的骨吸收,其中尤以牙周炎癥骨吸收最為嚴(yán)重廣泛。牙周病是一種影響牙齒支持組織的感染性疾病,表現(xiàn)出廣泛的臨床、微生物和免疫學(xué)臨床特征,并與多層面的特異性感染因子、宿主免疫反應(yīng)、環(huán)境因素及遺傳易感性等因素的動(dòng)態(tài)交聯(lián)反應(yīng)相關(guān)。牙周治療的理想目標(biāo)是牙周再生,即“完全的牙周結(jié)構(gòu)與功能性再生”。
　　MicroRNA分子在1993年由Lee等首先發(fā)現(xiàn)存在于線蟲細(xì)胞內(nèi),繼而被證實(shí)廣泛存在于動(dòng)

2、、植物體內(nèi),是真核細(xì)胞中一類非編碼調(diào)節(jié)性RNA,成熟的microRNAs通過(guò)識(shí)別并結(jié)合靶向互補(bǔ)mRNA3`非翻譯端,遏阻蛋白翻譯和或調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性,發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用,參與生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫防御、衰老、疾病等的過(guò)程,被認(rèn)為是先前生理與疾病研究中所缺失的環(huán)節(jié)。Lee等通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選出了正常與炎癥牙周組織中的差異表達(dá)MicroRNAs;Zhou等發(fā)現(xiàn)miR-18a等可促進(jìn)牙周膜來(lái)源干細(xì)胞的骨向分化,而miR-23a參與調(diào)

3、節(jié)成骨細(xì)胞的分化;Liu等人的研究發(fā)現(xiàn)MicroRNAs可持續(xù)調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境中牙周膜來(lái)源干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　現(xiàn)在人們對(duì)炎癥骨吸收機(jī)制的認(rèn)識(shí)并不完全,其中MicroRNAs是否起了作用?如果MicroRNAs在炎癥環(huán)境中調(diào)控骨改建,那么又是如何發(fā)揮作用的呢?
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　1.觀察大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周模型中牙周炎癥環(huán)境中骨吸收的的發(fā)生、發(fā)展及自愈情況,為后期動(dòng)物體內(nèi)移植提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2.建立下調(diào)和過(guò)表達(dá)mi

4、R-23a的大鼠成骨細(xì)胞,為后期體內(nèi)移植做準(zhǔn)備。
　　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
　　1采用結(jié)扎上頜右側(cè)第一磨牙的方法,誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的發(fā)生,32只雄性SD大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心)(200g.±50g)隨機(jī)分為4組:結(jié)扎7天組;結(jié)扎28天組;結(jié)扎28天后繼續(xù)喂養(yǎng)7;結(jié)扎28天繼續(xù)喂養(yǎng)28天;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取頜骨-牙體-牙周聯(lián)合樣本,做micro-CT掃描,用于作三維影像重建測(cè)量;脫鈣后石蠟包埋切片,用于HE染色、OPG免疫組織化學(xué)染色、

5、TRAP染色,觀察牙周炎癥和骨質(zhì)吸收情況。
　　2.選用新生SD大鼠籽鼠顱骨,II型膠原酶聯(lián)合EDTA消化,改良組織塊法培養(yǎng)成骨細(xì)胞,取傳代第一代及第二代生長(zhǎng)期細(xì)胞,經(jīng)由ALP、茜素紅染色鑒定,MTT測(cè)其增殖率;慢病毒構(gòu)建工作由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)服務(wù)公司完成,將獲得的慢病毒載體轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞,通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果并照相,并計(jì)算MOI值。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.(1)結(jié)扎7天組牙齦組織內(nèi)炎癥浸潤(rùn),牙槽骨表面有破骨

6、細(xì)胞生成,牙槽骨高度和根分叉下骨密度值稍下降,但與正常對(duì)照相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);(2)結(jié)扎21天組炎癥范圍擴(kuò)大,牙槽骨表面排列有大量破骨細(xì)胞,牙槽骨高度和骨密度值下降明顯,與正常對(duì)照相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);(3)結(jié)扎21天后去結(jié)扎7天組炎癥減輕,但仍有大量破骨細(xì)胞排列于牙槽骨表面,牙槽骨吸收情況緩解,骨密度值稍上升,但與結(jié)扎21天組相比,差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);(4)結(jié)扎21天后去結(jié)扎21組

7、牙周組織基本恢復(fù)正常,偶見破骨細(xì)胞,牙槽骨高度和骨值密度值明顯增加,與結(jié)扎21天組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.ALP、茜素紅染色鑒定結(jié)果顯示所培養(yǎng)細(xì)胞具有成骨礦化能力,為成骨細(xì)胞樣細(xì)胞;共聚焦圖片顯示慢病毒轉(zhuǎn)染成功,且可持續(xù)表達(dá)。
　　結(jié)論
　　1.利用結(jié)扎法可成功誘發(fā)大鼠牙周炎,去除結(jié)扎絲后,牙周炎癥得到控制,牙周組織的再生修復(fù)能力啟動(dòng),牙周骨質(zhì)再生。
　　2.成功分離、培養(yǎng)并建立慢病毒轉(zhuǎn)