AngⅡ及NE對過表達(dá)Gαq乳鼠心室肌細(xì)胞鈣信號的影響.pdf

1、心肌肥厚是心臟對多種疾病的適應(yīng)性反應(yīng),如高血壓、瓣膜病、心肌缺血等,持續(xù)的病理性刺激會引起心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和電生理學(xué)上的重構(gòu),這將大大增加了心律失常和心力衰竭的風(fēng)險。所以研究心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制、有效控制心肌肥厚的發(fā)展進(jìn)程對預(yù)防和治療心肌肥厚引發(fā)的心力衰竭具有重要的價值。
　　 眾多研究表明Gq通路的激活在心肌細(xì)胞肥大的過程中起到了至關(guān)重要的作用。Gq偶聯(lián)受體激動劑包括血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)、去甲腎上腺素

2、(norepinephrine,NE)、內(nèi)皮素(endothelin,ET)可誘發(fā)新生鼠左室心肌細(xì)胞(NRVMs)肥大。在NRVMs中過表達(dá)野生型Gaq蛋白可使心肌細(xì)胞肥大,而過表達(dá)持續(xù)激活的Gaq突變體蛋白,最初引起心肌細(xì)胞肥大進(jìn)而發(fā)展為心肌壞死。通過轉(zhuǎn)基因方法在小鼠心臟中特異性表達(dá)Gαq蛋白,可使心臟的重量以及心肌細(xì)胞的大小都明顯的增加,ANP、α-action和β-MHC等胎兒基因的表達(dá)也明顯增加。
　　 迄今為止Gq通路

3、激活引起心肌細(xì)胞肥大發(fā)生的機(jī)制尚不清楚。而Ca+在心肌肥厚發(fā)生過程中的作用近年來越來越受到人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高可激活細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)磷酸酶(CaN),進(jìn)而激活活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT),從而引起肥厚相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄增加,這一通路可能在心肌肥厚的發(fā)生過程中具有重要的作用。但Gq通路激活以及過表達(dá)Gaq引發(fā)的心肌肥厚是否通過對細(xì)胞內(nèi)鈣信號產(chǎn)生影響而實(shí)現(xiàn)

4、的目前還不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)首先利用Adeasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建含小鼠野生型Gαq基因的重組腺病毒載體,再使其轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞,觀察過表達(dá)Gaq的乳鼠心肌細(xì)胞在AngⅡ、NE作用下細(xì)胞內(nèi)鈣信號的變化,以研究Gq通路激活引起心肌肥厚與細(xì)胞內(nèi)鈣信號的關(guān)系。
　　 第一部分?jǐn)y帶小鼠野生型Gαq基因的重組腺病毒載體的構(gòu)建
　　 目的:利用Adeasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建含小鼠野生型Gaq基因的重組腺病毒,并在HEK293A細(xì)胞中進(jìn)

5、行重組腺病毒pAd-Gαq-GFP的擴(kuò)增制備。
　　 方法:(1)目的基因pGEMHE-Gαq經(jīng)PCR加入SpeⅠ和PvuⅠ兩個酶切位點(diǎn)并大量擴(kuò)增,凝膠電泳鑒定,正確PCR產(chǎn)物膠回收提純。(2)PCR產(chǎn)物與穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-1經(jīng)SpeⅠ和PvuⅠ充分消化,將其產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接,構(gòu)建成功的質(zhì)粒pShuttle-Gaq經(jīng)凝膠電泳鑒定,同時送測序公司測序。(3)經(jīng)測序證實(shí)后的pShuttle-Gaq依

6、次進(jìn)行PmeⅠ線性化、純化、去磷酸化、膠回收等處理。通過Bio-Rad電轉(zhuǎn)化儀將線性化后的pShuttle-Gaq轉(zhuǎn)化入BJ-5183-Adeasy感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行同源重組。經(jīng)凝膠電泳鑒定成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增。(4)重組腺病毒質(zhì)粒pAd-Gaq-GFP經(jīng)PacⅠ線性化后,用酚-氯仿提純質(zhì)粒。純化后的線性重組腺病毒質(zhì)粒pAd-Gaq-GFP經(jīng)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞,包裝制備腺病

7、毒顆粒。(5)將原代病毒液反復(fù)凍融3次后,繼續(xù)感染HEK293A細(xì)胞進(jìn)行病毒顆粒的擴(kuò)增。包裝成功的病毒顆粒感染HEK293A細(xì)胞后提取全細(xì)胞蛋白經(jīng)western-blot方法鑒定是否達(dá)到過表達(dá)Gq蛋白的目的。
　　 結(jié)果:
　　 (1)PCR擴(kuò)增方法將SpeⅠ和PvuⅠ兩個酶切位點(diǎn)加入Gaq cDNA兩端,經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定,PCR產(chǎn)物片段長度約1kb,與預(yù)期大小1098bp相符。
　　 (2)以上PCR產(chǎn)

8、物與穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-1分別經(jīng)SpeⅠ和PvuⅠ酶切消化,酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接構(gòu)成質(zhì)粒pShuttle-Gaq。質(zhì)粒pShuttle-Gaq中插入片段序列正確性經(jīng)酶切鑒定和DNA測序證實(shí)。
　　 (3)測序證實(shí)后的質(zhì)粒pShuttle-Gaq經(jīng)PineⅠ線性化后,經(jīng)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入攜帶腺病毒骨架pAdeasy的BJ-5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行同源重組。同源重組后挑選出的陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,

9、擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切鑒定,可得一條約30 Kb大小的片段和3 Kb或者4.5 Kb大小的片段。由此可知重組pAdeasy-Shuttle-Gαq質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 (4)經(jīng)PacⅠ線性化的pAdeasy-Shuttle-Gαq質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞,可觀察到細(xì)胞病理變化(cytopathic effect,CPE),即展開的細(xì)胞經(jīng)病毒顆粒感染后出現(xiàn)細(xì)胞慢慢變圓、飄起的現(xiàn)象。CPE現(xiàn)象可以說明已包裝出病毒顆粒。

10、>　　 (5)經(jīng)Western-blot檢測感染腺病毒pAd-Gαq-GFP的HEK293A細(xì)胞中Gαq蛋白的表達(dá)量明顯增加,表明該病毒可成功實(shí)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中過表達(dá)Gαq蛋白的目的,能滿足下一步的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 結(jié)論:利用Adeasy腺病毒載體成功構(gòu)建了含有小鼠Gαq基因的腺病毒顆粒,為下一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分腺病毒pAd-Gαq-GFP轉(zhuǎn)染乳鼠心室肌細(xì)胞及對細(xì)胞內(nèi)鈣信號的影響
　　

11、 目的:通過腺病毒pAd-Gαq-GFP轉(zhuǎn)染在離體培養(yǎng)的乳鼠左心室肌細(xì)胞(NRVMs)中過表達(dá)Gαq,通過激光共聚焦顯微鏡觀察給予心肌肥厚激動劑AngⅡ和NE后心肌細(xì)胞內(nèi)鈣信號的變化,從而探討Gq通路激活引起心肌肥厚與細(xì)胞內(nèi)鈣信號的關(guān)系。
　　 方法:(1)NRVMs的分離及培養(yǎng):在無菌條件下,應(yīng)用終濃度為0.04％胰酶、0.06％膠原酶Ⅱ的混合液反復(fù)消化出生2-3天的乳鼠心肌組織6-7次,用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中和收

12、集到的細(xì)胞懸液,用差速貼壁法和溴脫氧尿嘧啶(Brdu)相結(jié)合的方法純化細(xì)胞,置CO2培養(yǎng)箱孵育。(2)腺病毒pAd-Gαq-GFP轉(zhuǎn)染NRVMs:用稀釋好的病毒液替換NRVMs的培養(yǎng)液,CO2培養(yǎng)箱孵育48 h,觀察轉(zhuǎn)染效率并經(jīng)Westen-blot檢測目的蛋白表達(dá)情況。(3)激光共聚焦顯微鏡下觀察NRVMs內(nèi)鈣的變化:Rhod2-AM負(fù)載心肌細(xì)胞15 min后,灌流給予5μM AngⅡ和NE,觀察心肌細(xì)胞內(nèi)鈣的變化。
　　 結(jié)

13、果:
　　 (1)分離的NRVMs培養(yǎng)48h后心肌細(xì)胞展開并伸出的偽足,相互交織在一起形成多個細(xì)胞簇,每個細(xì)胞簇中的細(xì)胞呈放射狀排列,并可同步化搏動,說明細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　 (2)將第一部分構(gòu)建的重組腺病毒pAd-Gαq-GFP感染NRVMs細(xì)胞48h后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察可見大多數(shù)細(xì)胞具有綠色熒光的表達(dá),說明腺病毒的轉(zhuǎn)染效率較高,Westen-blot結(jié)果顯示感染腺病毒pAd-Gαq-GFP的NRVMs細(xì)胞中G

14、αq蛋白的表達(dá)為對照組細(xì)胞的3.5倍,提示腺病毒pad-Gαq-GFP感染成功在NRVMs細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)Gαq蛋白。
　　 (3)腺病毒轉(zhuǎn)染48h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察給予5μM的AngⅡ或NE前后過表達(dá)Gαq蛋白的NRVMs細(xì)胞內(nèi)鈣的變化,結(jié)果顯示與對照組相比5μM AngⅡ和NE可明顯增加過表達(dá)Gαq的NRVMs細(xì)胞鈣振蕩的頻率,而且過表達(dá)Gαq的NRVMs在AngⅡ作用下基礎(chǔ)的鈣升高幅度也明顯增加。
　　 結(jié)論: