3938例發(fā)熱呼吸道樣本病毒譜流行規(guī)律及新甲型H1N1流感病毒變異研究.pdf

1、急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection，ARTI)為臨床常見病和多發(fā)病，其中約70～80％為病毒感染，主要有流感病毒，副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒等，且人群普遍易感[1-4]。隨著全球氣候變化及環(huán)境污染等諸多因素的影響，近幾年呼吸道病毒流行呈活躍勢(shì)態(tài)。2003年由冠狀病毒引起的以肺炎為主要表現(xiàn)的嚴(yán)重呼吸道綜合癥(SARS)[2-3]，2005年由高致病性禽流感病毒(H5N1)引起的呼吸

2、道疾病，特別是2009年由新甲型流感病毒(novel H1N1)引起的世界范圍內(nèi)的流感大流行，導(dǎo)致大量的人員死亡和財(cái)產(chǎn)損失[4-7]。這些呼吸道病毒的抗原發(fā)生變異，使其容易有效地突破人群的免疫屏障，引起呼吸道感染疾病的流行[8]，因此對(duì)呼吸道病毒的監(jiān)測(cè)及其抗原變異的探討研究對(duì)呼吸道感染的防治具有重要意義。
　　目的：
　　1、調(diào)查2009-2010年發(fā)熱呼吸道癥候群7種病毒（人流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、人

3、偏肺病毒、人腺病毒、人冠狀病毒和人博卡病毒）感染情況;了解本省發(fā)熱呼吸道病毒感染的流行病學(xué)特征;明確影響發(fā)熱呼吸道病毒檢出率的影響因素，為發(fā)熱呼吸道病毒的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。
　　2、通過對(duì)新甲型H1N1流感病毒的血凝素抗原(HA)片段進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，分析新甲型H1N1流感病毒分離株的基因特征，進(jìn)一步了解新甲型H1N1流感病毒的分子生物學(xué)性狀及與其他甲型流感病毒毒株的遺傳進(jìn)化距離，探討我省新甲型H1N1流感病毒HA抗原性變異

4、的分子基礎(chǔ)。為流感病毒的變異變遷、疫苗的完善和藥物敏感性研究打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、臨床標(biāo)本檢測(cè)及病毒分離:采用一步法熒光定量RT-PCR探針法和普通PCR或RT-PCR法對(duì)發(fā)熱呼吸道感染患者的標(biāo)本進(jìn)行7種病毒的檢測(cè)，將本實(shí)驗(yàn)室部分新甲型H1N1流感病毒檢測(cè)陽性標(biāo)本接種到犬腎細(xì)胞系(MDCK)進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)。
　　2、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn):對(duì)分離毒病株采用流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，并使用自己設(shè)計(jì)的新甲型H1

5、N1流感毒HA和NA區(qū)特異性引物分別對(duì)毒株進(jìn)行擴(kuò)增;對(duì)于其他類型病毒核酸檢測(cè)為陽性的標(biāo)本，進(jìn)行普通RT-PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送杭州華大基因有限公司測(cè)序。
　　3、生物信息學(xué)分析:參考甲型流感病毒各型別的代表株(特別是新甲型H1N1)以及中國大陸其他地區(qū)測(cè)定的甲型流感病毒序列，應(yīng)用DNASTAR、DANMAN等生物學(xué)軟件對(duì)浙江地區(qū)新甲型H1N1流感病毒HA的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)的分析。
　　結(jié)果：
　　1、采用

6、發(fā)熱呼吸道病毒核酸檢測(cè)試劑盒共檢測(cè)發(fā)熱呼吸道臨床診斷病例3938例，采集樣本4386份;浙江、江蘇、福建三省均有病例，最多為2393例（浙江）;各月均有病例，最少為18例（2009年2月），最多為393例(2009年11月);病例男女性別比為1.50∶1;5歲以下病例占全部病例的20.75％;門急診病例來源的病例占全部病例的76.70％。
　　2、發(fā)熱呼吸道癥候群病原體總檢出率為39.64％(942/3372);其中，病毒檢出率為

7、33.41％(847/2535);每年10月-3月是病毒檢出率的高峰期，特別是人流感病毒;5歲以下病例病毒的檢出率為31.99％，5歲及以上病例病毒的檢出率為33.89％;
　　3、發(fā)熱呼吸道癥候群各病毒檢出率分別為:人流行性感冒病毒(20.28％)、呼吸道合胞病毒(6.19％)、人副流感病毒(4.81％)、人腺病毒(1.46％)、人偏肺病毒(1.22％)、人冠狀病毒(1.38％)、人博卡病毒(1.15％)。
　　4、我們共

8、分離135株新甲型H1N1流感病毒分離株，并選擇50株對(duì)HA片段分別進(jìn)行基因序列測(cè)定，核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，彼此之間的同源性都較高，HA為:99.7-100.0％;與GenBank中的新甲型H1N1流感病毒參考株相比，HA同源性為:99.3-100.0％，且HA的變異性相對(duì)較小。
　　結(jié)論:
　　1、發(fā)熱呼吸道患者的病源譜構(gòu)成以人流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒為主。
　　2、每年10月-3月是病毒

9、檢出率的高峰期，特別是人流感病毒;5歲以下與5歲及以上病例病毒的檢出率并無明顯區(qū)別;男女性別的檢出率無顯著差異。
　　3、新甲型H1N1流感毒株基因分型及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，浙江地區(qū)與國內(nèi)和國外分離株流行一致。核苷酸和氨基酸僅部分發(fā)生了輕微變異，但在重癥新甲型H1N1患者中分離的一株病毒Hangzhou3-2009與浙江義烏的A/Zhejiang-Yiwu/11/2009(H1N1)的HA蛋白均發(fā)生D222G突變，該株變異與患者的